Pages
UG, Fac. Bio-ingenieurswetenschappen, Vakgroep Gewasbescherming, labo Fytopathologie
Contact details
Traineeship proposition
Abstract
Testimony
Admin
Stageonderwerp 2012-2013: Rol van lipopeptiden geproduceerd door fluorescerende pseudomonaden in ziekte en biologische bestrijding
Fluorescerende pseudomonaden zijn bacteriën die ziekte bij planten kunnen veroorzaken of planten juist kunnen beschermen tegen ziekte doordat ze antagonistisch werken ten opzichte van plant pathogene schimmels. Aan het labo Fytopathologie van de Universiteit Gent zijn we geïnteresseerd in cyclische lipopeptiden die door fluorescerende pseudomonaden worden geproduceerd en die naar gelang hun structuur necrose veroorzaken in de plant, of de plant juist beschermen tegen fytopathogenen. We bestuderen de rol en regulatie van deze cyclische lipopeptiden via mutanten-analyse, biochemische analyses en plantenexperimenten. De student zal betrokken worden in dit project en leren hoe mutanten kunnen geconstrueerd worden via plaats-specifieke mutagenese. Deze mutanten zullen getest worden op hun vermogen planten ziek te maken of juist te beschermen. Experimenten met de plantpathogene bacterie P. cichorii zullen worden uitgevoerd op sla. Biocontrole experimenten zullen worden uitgevoerd op boon. Goedaardige Pseudomonas bacteriën (Pseudomonas sp. CMR12a) of mutanten worden toegevoegd aan de grond, waarna de boontjes worden gezaaid en geïnfecteerd met de schimmel Rhizoctonia solani.
Stageonderwerp 2008-2009
De activiteiten van de stage zijn gekaderd in een project over de biologische bestrijding van Pythium spp. door fluorescerende pseudomonaden. Er wordt o.a. gewerkt met het cocoyam-Pythium myriotylum pathogeensysteem. In dit onderzoek gaat er veel aandacht naar de eigenschappen en genetische regulatie van de antimicrobiële metabolieten die geproduceerd worden door deze bacteriën, met name fenazine-antibiotica en biosurfactants. Het is geweten dat de productie van fenazines in fluorescerende Pseudomonas spp. gereguleerd wordt door een quorum sensing systeem gecodeerd door phzI/phzR-genen. Over het effect van dit quorum sensing systeem op biosurfactantproductie is echter nog weinig bekend. De modelstam van dit onderzoek is Pseudomonas CMR12a, een zeer goede antagonist, die in staat is verschillende pathogenen te inhiberen. CMR12a produceert een 5-tal verschillende acyl-homoserinelactons (AHL’s), signaalmoleculen van het quorum sensing systeem. De genen phzI en phzR werden in CMR12a reeds gekarakteriseerd, maar het belang van deze quorum sensing voor de productie van fenazines en biosurfactants in CMR12a is nog niet bekend.
Het project van de student bestaat voornamelijk uit de constructie en karakterisatie van een quorum sensing mutant in CMR12a. Allereerst moet een mutatieconstruct gemaakt worden, waarvoor een systeem gebaseerd op in vivo cloning in bakkersgist gebruikt wordt. Verschillende moleculaire technieken, zoals PCR, klonering en elektroporatie komen hierbij aan bod. Vervolgens wordt een deletiemutant in de quorum sensing genen geconstrueerd via een plaatsspecifieke mutagenese gebaseerd op dubbele homologe recombinatie. Het mutatieconstruct wordt via een biparentale conjugatie ingebracht in CMR12a, waarna verschillende selectiestappen op selectief medium volgen en uiteindelijk PCR om de mutant op genetisch niveau te bevestigen.
Eens de mutant beschikbaar is, worden een aantal karakteristieken vergeleken met die van het wild type. Om na te gaan hoe de productie van AHL’s is aangetast in de mutant, worden ze geëxtraheerd, gescheiden via TLC en vervolgens gedetecteerd met een overlay van sensorbacteriën. Fenazineproductie wordt nagegaan via extractie, TLC en detectie onder UV-licht, of via HPLC. Biosurfactantproductie kan gequantificeerd worden via de zgn. “Wilhelmy plaatmethode”, gebaseerd op de verlaging van oppervlaktespanning die biosurfactants veroorzaken in een vloeistof. Verschillende andere karakteristieken, zoals de productie van HCN, sideroforen en exoproteasen en motiliteit kunnen met eenvoudige maar gevarieerde assays nagegaan worden.
Tenslotte wordt het vermogen van de mutant om het tropisch gewas cocoyam te beschermen tegen de wortelrotpathogeen Pythium myriotylum getest via een serre-experiment. Hierbij worden de pathogeen en de bacteriën (wild type CMR12a of zijn quorum sensing mutant) toegevoegd aan het substraat, waarna jonge cocoyams geplant worden. De benodigde plantjes moeten via in vitro propagatie verkregen worden. De ziekte-ontwikkeling van de planten wordt opgevolgd met een scoringsmethode en statistisch verwerkt. Na enkele weken wordt ook de kolonisatiecapaciteit van CMR12a en zijn mutant bepaald. De wortelstelsels van de planten worden verwijderd, afgespoeld en gegrind in fysiologische oplossing. Van de bekomen suspensie worden verdunningsreeksen uitgeplaat, waaruit het aantal bacteriën op de wortels kan afgeleid worden.
Stageonderwerp 2007-2008
Verticillium longisporum is een bodemschimmel die overleeft onder de vorm van microscleroten en een ernstige verwelkingsziekte bij bloemkool veroorzaakt. In het kader van een IWT landbouwproject worden bestrijdingsstrategieën op basis van organisch materiaal en microbiële antagonisten onderzocht. Hierbij worden onder andere de effecten op de overleving van de microscleroten nagegaan. Tijdens ons onderzoek is gebleken dat in bepaalde gronden in West-Vlaanderen naast Verticillium longisporum ook Verticillium tricorpus wordt aangetroffen. De aanwezigheid van Verticillium tricorpus heeft een duidelijke invloed op de verwelkingsziekte, de bloemkoolplanten worden veel minder ziek zelfs als de grond ook Verticillium longisporum bevat. De aanwezigheid van Verticillium tricorpus wordt blijkbaar bevorderd bij aardappel als voorvrucht. De volgende taken kunnen uitgevoerd worden:
- Bepalen van Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum scleroten in landbouwgronden door de natte zevingstechniek gecombineerd met microscopie.
-Bevestiging van de aanwezigheid van beide Verticillium soorten via species specifieke PCR.
-Rechtstreekse detectie van Verticillium in gronden via PCR.
-Verdere screening naar aanwezigheid van Verticillium tricorpus in bloemkoolvelden waar nooit problemen met Verticillium longisporum worden gesignaleerd en in velden waar aardappel wordt geteelt.
-Nader onderzoek naar het antagonisme van Verticillium tricorpus tegen Verticillium longisporum. Hiertoe zullen onder gecontroleerde omstandigheden experimenten worden uitgevoerd waarbij bloemkoolplanten eerst met Verticillium tricorpus worden geïnoculeerd en daarna worden uitgeplant in grond besmet met Verticillium longisporum. Het ziekteverloop in deze planten zal worden opgevolgd in vergelijking met controleplanten die niet behandeld worden met Verticillium tricorpus. Nadien zal Verticilllium opnieuw uit deze planten worden geïsoleerd.
Vaardigheden die worden aangeleerd: werken met schimmels, verschillende detectiemethodes voor schimmels, DNA extractie uit gronden, PCR, artificiële infectie van planten met pathogenen, experimenten opzetten ivm. biologische bestrijding, isoleren van Verticillium uit aangetast plantenweefsel, statistische verwerking van data.
Algemeen
Aan dit laboratorium wordt er onderzoek gedaan naar plantenziekten veroorzaakt door schimmels en bacteriën. Onderzoeksthema's die aan bod komen zijn:
- biologische en geïntegreerde bestrijding van fungale bodempathogenen
- de rol van plantenhormonen in plant-pathogeen interacties
- natuurlijke en geïnduceerde resistentiemechanismen in planten
- biologische en geïntegreerde bestrijding van fungale bodempathogenen
- de rol van plantenhormonen in plant-pathogeen interacties
- natuurlijke en geïnduceerde resistentiemechanismen in planten
Vooral in het onderzoek naar biologische en geïntegreerde bestrijding is er plaats voor stagiaires met een interesse in micro-organismen, planten en eventueel moleculaire biologie. Technieken die aan bod kunnen komen zijn:
- algemene microbiologische technieken
- werken met schimmels; onder andere schimmelbepalingen in grond
- plant-pathogeen experimenten
- moleculaire technieken zoals PCR, RFLP-PCR, eventueel ook kwantitatieve PCR en AFLP
- bepaalde enzymatische technieken
Nadere informatie over het onderzoek aan dit labo is ook te vinden op de website
http://www.fytopath.ugent.be/
Download Presentatie (1.85 MB)Samenvatting eindwerk 2008-2009: Quorum sensing regulatie in Pseudomonas spp. CMR12a en CMR12b
Cocoyam (Xanthosoma sagittifolium) is een tropisch knolgewas. In West-Afrika is cocoyam één van de belangrijkste planten voor voedselvoorziening. Cocoyam wordt belaagd door een schimmelachtige die wortelrot veroorzaakt. Uit de rhizosfeer van de cocoyam zijn enkele Pseudomonas spp. geïsoleerd, waaronder CMR12a en CMR12b. CMR12a kan de wortelrot onderdrukken zodat de cocoyam niet sterft. Beide pseudomonaden produceren fenazine-antibiotica die gereguleerd is door quorum sensing, dat is een celdensiteitsafhankelijkgenregulatie-mechanisme. Dit regulatiemechanisme is echter nog niet goed bestudeerd in CMR12a en CMR12b. Om het te onderzoeken worden er via plaatsspecifieke mutagenese deleties gemaakt in phzI en phzR. Deze genen worden verondersteld de biosynthese van fenazine te regelen via quorum sensing. Vervolgens wordt het fenotype van het wild type en de quorum sensing mutanten vergeleken. Na de vergelijking van het fenotype kan men afleiden dat phzI instaat voor de productie van acyl-homoserinelactons (AHL), de signaalmoleculen van het quorum sensing systeem. De AHL’s regelen de productie van fenazine en pyoverdine, terwijl PhzR enkel de fenazineproductie beïnvloedt. PhzR staat ook in voor de autoinductie van phzI. In CMR12b zijn er mogelijk 2 phzI’s omdat de CMR12b-PhzI-mutant wel nog AHL’s produceert maar wel minder dan het wild type. Uit de infectieproef kan afgeleid worden dat de CMR12a-PhzI-mutant zijn koloniserend vermogen verliest en dus de cocoyam niet meer kan beschermen.
Samenvatting eindwerk 2007-2008: interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool
Verticillium longisporum is een pathogeen bij bloemkool en veroorzaakt vergeling, verwelking en dwerggroei. De ziekte wordt ook wel verwelkingsziekte of slaapziekte genoemd. Enkele Verticillium spp. produceren microscleroten. Dit zijn overlevingsstructuren die tot 15 jaar in de grond kunnen overleven. Eens de ziekte in het veld is, is deze dus zeer moeilijk weg te krijgen. De ziekte heeft dus een grote impact voor telers door de dalende kwaliteit en opbrengst die ermee gepaard gaat. In de regio van Klein-Brabant wordt de bloemkoolteelt al enkele jaren zwaar geteisterd door Verticillium. In West-Vlaanderen duikt de ziekte ook al sporadisch op. Uit voorgaande veldproeven bleek dat er in West-Vlaanderen naast V. longisporum nog een ander species van Verticillium aanwezig is, nl. V. tricorpus. In velden waar beide species voorkwamen werd meestal geen ziekte vastgesteld. Dit suggereert dat V. tricorpus een onderdrukkend effect heeft op de ziekte veroorzaakt door V. longisporum. V. tricorpus is een zwak pathogeen en in literatuur werd reeds aangetoond dat deze schimmel de ziekte veroorzaakt door V. dahliae kon onderdrukken bij aardappel en sla.
In dit werk werd de interactie van V. tricorpus en V. longisporum grondig bestudeerd. De pathogeniciteit en interactie werd bestudeerd met in vitro en in vivo experimenten. Bij het in vitro experiment werd een grotere hoeveelheid microscleroten waargenomen bij de wortels van de bloemkolen ‘Clapton’ geïnoculeerd met V. tricorpus dan deze geïnoculeerd met V. longisporum. Dit wijst hoogstwaarschijnlijk op de resistentie van de plant t.o.v. V. tricorpus. Ook zag men dat V. tricorpus een groeistimulatie gaf bij de bloemkoolplanten ‘Clapton’. Dit was echter niet het geval bij het in vivo experiment, waarbij het bloemkoolras ‘Cornell’ gebruikt werd. Een mogelijke reden hiervan is het verschillend ras en de wijze van inoculatie. Ook is het mogelijk dat deze groeistimulans maar te zien is bij het begin van de groei. In dit experiment veroorzaakte V. tricorpus geen vasculaire zwartverkleuring van de stam en kon niet herisoleerd worden vanuit de bladeren of stam, terwijl V. longisporum de typische symptomen veroorzaakte en dikwijls ook herisoleerd kon worden vanuit de bladeren. Hoogstwaarschijnlijk is het ras ‘Cornell’ resistent tegen V. tricorpus kolonisatie, zoals gesuggereerd werd in het experiment in vitro met het ras ‘Clapton’. De pre-inoculatie met V. tricorpus kon de planten ‘Cornell’ niet beschermen tegen V. longisporum gedurende de 6 weken na inoculatie. Zeven weken na inoculatie leek de aanwezigheid van V. tricorpus toch een afzwakking van de stijging van de ziekte-index te weeg te brengen. Het experiment was gelimiteerd door de beperkte potgrootte en werd beëindigd 9 weken na inoculatie van de schimmels. Het zou dus interessant zijn om dit experiment nogmaals te herhalen voor een besluit getrokken wordt.
Een tweede doelstelling in dit eindwerk was de detectie van microscleroten afkomstig van Verticillium in de grond. De meest gebruikte techniek hiervoor is de uitplating op MSEA (Modified Soil Extract Agar). Omdat deze techniek tijdrovend is en soms moeilijk onderscheid gemaakt kan worden tussen de microscleroten van de species, werd geprobeerd een species-specifieke PCR voor detectie van verschillende Verticillium spp. in grondstalen te optimaliseren. Dit werd uitgevoerd a.d.h.v. DNA van zuivere kolonies van de verschillende species en van enkele grondstalen waarvan men wist welke species aanwezig waren. De optimalisatie is echter nog niet voltooid.
Een laatste doelstelling was te bevestigen of er effectief een verschil van voorkomen van V. tricorpus en de voorteelt merkbaar was. Ook wilden we de correlatie bekijken tussen het voorkomen van V. tricorpus en de aantasting in gronden van West-Vlaanderen en Klein Brabant. Praktisch alle grondstalen afkomstig van West-Vlaanderen bevatten microscleroten van V. tricorpus wat ook bleek uit voorgaande studies. In Klein-Brabant werd slechts in één grondstaal V. tricorpus waargenomen. De voorteelt lijkt een effect te hebben, maar verder onderzoek is hier vereist.
Address
|
Coupure Links 653
9000 Gent
09 2646017 Belgium |
Contacts
|
Traineeship supervisor
Monica Hofte
09 2646017 monica.hofte@ugent.be |
|
Traineeship supervisor
Jolien D’aes
09 2646022 jolien.daes@ugent.be |