Search form

UZ Gent afdeling reumatologie (labo voor moleculaire immunologie)

Contact details
Traineeship proposition
Abstract
Testimony
Admin
 
Stageonderwerp 2012-2013: Optimalisatie voor gevoelige detectie van ontstoken gewrichten
Om beter inzicht te krijgen in de ziekte van reumatoïde arthrititis, wordt vooral onderzoek verricht in ontstoken muisknieën.  Bot is een vrij harde structuur en dit zorgt voor een aantal praktische problemen.  Dit vergt dan ook wat optimalisatie.  
 
Voorstel stageonderwerp 2012-2013:
Onderzoek naar oorzaken van inflammatoire gewrichtsontsteking
Reumatoïde artritis (RA) is één van de meest voorkomende auto-immuunziekten en het meest frequente type van auto-immuunartritis met een wereldwijde prevalentie tussen 0,5 en 1%. De oorzaak ervan is echter nog niet gekend en tot op heden zijn er nog geen behandelingen die RA kunnen genezen. In ons laboratorium wordt voor het onderzoek naar de oorzaak en mogelijke behandelingen zowel gebruik gemaakt van humaan weefsel als van muizen.
Van patiënten met een gewrichtsontsteking in de knie wordt via naaldartroscopie een weefselbiopt uit de knie genomen, waarop in het labo immunohistochemische en immunofluorescente kleuringen worden uitgevoerd.
Het standaard muizenmodel voor artritis bestaat erin muizen te immuniseren met collageen (Collagen Induced Arthritis). Na verloop van tijd vertonen de meeste muizen zwelling en roodheid van de gewrichten. De evolutie van de geïnduceerde artritis van behandelde of transgene muizen in vergelijking met controle muizen wordt nagegaan door het dagelijks klinisch scoren en de bepaling van serummerkers met de ELISA techniek. Op het einde van het experiment worden de knieën histologisch geanalyseerd op verschillende parameters typisch voor artritis.
 
Technieken: histopathologie (inbedden, processing, paraffine coupes snijden, vriescoupes snijden), immunohistochemische kleuringen, immunofluorescente kleuringen, microscopie, ELISA
 
 
Stageonderwerp 2005-2006
Onderzoek naar oorzaken van inflammatoire gewrichtsontsteking.
Technieken:  histopathologie ( inbedden, processing, paraffine coupes maken), microscopie, histochemische kleuringen, flowcytometrie
 
Voorstel (2005-2006): De rol van NKT cellen bij de ontwikkeling van auto-immuunziekten
Natural Killer T (NKT) cellen spelen een belangrijke rol in de bescherming van het individu tegen infecties, tumorontwikkeling en de preventie van auto-immuunziekten. Daarom is er gedurende de laatste jaren veel interesse naar Natural Killer T lymfocyten als doelwit voor de ontwikkeling van therapeutica.
In tegenstelling tot conventionele T cellen, die geactiveerd worden door peptiden, worden NKT cellen geactiveerd na herkenning van bepaalde glycolipiden. Eén van deze glycolipiden is het glycosfingolipide α-galactosylceramide (α-GalCer). De mogelijkheid van α-GalCer om grote hoeveelheden cytokines te induceren, maakt van α-GalCer een interessante vertrekmolecule voor de ontwikkeling van therapeutica voor verscheidene ziektemodellen.
Het doel van deze thesis omvat een studie van de karakterisatie van NKT cellen en een studie naar de therapeutische activiteit van nieuw gesynthetiseerde α-GalCer-analogen in twee muismodellen voor reumatoïde artritis.
Voor deze thesis zal gebruik gemaakt worden van proefdieren en van technieken zoals ELISA, histologie, immunohistochemie, flow cytometrische analyse en PCR.

Abstract Bachelor Project 1 FBT 2019-2020: Effect of modulation of gut microbiota in spondyloarthritis

The aim of this project was to unravel the role of the gut microbiota in spondyloarthritis disease. To achieve this, two different experiments were set up. For the first experiment, SKG mice were given either antimycotic (fluconazole) or antibiotic (amoxicillin) treatments to better understand their impact on SpA progression, as to validate the findings of a previous experiment using the TNFdare mouse line. By scoring the clinical manifestations during the growth of these mice as well as histological scoring, the influence of these microbial lifeforms on SpA is checked. Ankle and ileum samples were collected, and ankle samples were processed to slides for the scoring. The resulting raw data was statistically analysed. This analysis concluded that neither treatment proved to have a significant influence on disease progression for the SKG mice. The second experiment focused on Dialister invisus and Prevotella copri, two important biomarkers in human SpA disease. The aim of this second experiment was to try and colonise the gut of mice with D. invisus and P. copri to lead the way to future testing on these bacteria in vivo. A dysbiosis was created in the gut of the mice before administering the bacteria by gavage, and DNA extracted from stools was checked using qPCR to determine if the colonisation was successful. Primers used in the qPCR turned out to be insufficiently specific and precise to measure the colonisation if it did succeed in a small quantity. In conclusion, further testing is required to validate the findings of the SKG mice experiment, to find out if there are possible genetical differences or different gut microbiota that cause these mice to react to the treatment differently than the TNFdare mice. Further and more in depth sequencing of the bacterial DNA extracted from the stools used in experiment 2 will need to be performed to find out the influence of these bacteria on SpA disease in the mouse model.

 

Abstract Bachelor Project 2 FBT 2019-2020: Study of the evolution of a TGF-β superfamily member in serum from different mouse models for osteoarthritis and rheumatoid arthritis

Rheumatoid arthritis and osteoarthritis are most common in the Western society and are clearly on the rise. Therefore, it is important to unravel the mechanisms of inflammation and immunity for these diseases in order to offer better prevention and recovery for the patients. In a previous study it was shown that mice lacking a transforming growth factor beta (TGF-β) superfamily member become sicker in a cartilage model when compared to wildtype littermates. On the other hand, the same type of mice become less ill in an inflammation model. These findings show that this cytokine may play a role in both diseases. In this study, the course of the TGF-β superfamily member is studied in three different mouse models, namely a surgical model of destabilization of the medial meniscus, a collagen induced arthritis model and a collagen antibody induced arthritis model. The first model is a cartilage model and the latter two are inflammation models. To measure the concentration of the cytokine, an Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) is used. On the obtained concentrations, a number of statistical tests are performed where the majority of the results are without significant difference. Because of this, it is not possible to assign a specific function to the TGF-β superfamily member. In the cartilage model, this cytokine may fulfill a protective role. In the two inflammation models, this member could still play a role in the synovial inflammation, as relevant trends are observed. As expected, the cytokine levels correlate with the age of the mice. 

 

Abstract Bachelor Project 1 FBT 2018-2019: Research into the role of a TGFb superfamily member in osteoporosis

Preliminary studies indicate that a transforming growth factor beta (TGFb) superfamily member might play a role in cartilage and bone erosion in the context of arthritis, yet it remains unknown whether these effects are also related to osteoporosis. Some mice studies have suggested that osteoporosis has an inhibitory effect on osteoclasts which goes against the conclusions of other studies that suggest it has an activating effect on osteoclasts. The purpose of this research is to determine the potential role of the transforming growth factor beta (TGFb) superfamily member in the context of osteoporosis using the ovariectomy osteoporosis mouse model. Knock out (KO) mice and control wild type (WT) mice underwent ovariectomy or SHAM surgery to induce postmenopausal osteoporosis. A successful surgery was confirmed by histology of the ovaries and a weight follow-up to evaluate menopause. Six weeks post-surgery, bone strength was tested using a femur bending test. Also, bone geometry was analyzed using computed tomography (CT) scans. Lastly, two bone resorption regulating cytokines were measured using Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). The femur bending test indicates that the bone, originating from the osteoporosis mouse model (OVX), breaks at a significantly lower force compared to the SHAM mice. Moreover, the µCT-analysis indicates that cortex volume, trabeculae volume and bone density are significantly higher among the OVX groups compared to the SHAM groups. In both experiments, the KO mice and the WT mice show no significant difference. Beyond that, the ELISA quantification of two bone resorption regulating cytokines in serum shows a not significant trend. For this reason the ELISA experiment still needs extra optimization. In general, the osteoporosis mouse model shows a recurring trend in which both bone geometry and bone strength are significantly reduced compared to the control mice. Additionally, KO mice show no significant difference compared to the control mice.

 

Abstract Bachelor Project 2 FBT 2018-2019: Optimization of the in vitro activation of primary synovial fibroblasts using Western blot

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune disease that affects approximately 1% of the world population. In this disease, many signaling pathways are aberrantly activated, leading to auto-reactive T-cells and autoantibodies. One of these pathways is the nuclear factor-kappa B (NF-kB) pathway, which is of high interest in the study for new therapies for RA. Besides T-cells and autoantibodies, synovial fibroblasts are thought to be central players in the disease. This cell type has a destructive potential that is boosted by inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-a (TNF-a), interleukin (IL)-1b and IL-17.

The ultimate goal of this project is to study the role of specific regulatory mechanisms of the NF-

kB pathway in synovial fibroblasts. More specifically, NF-kB activation will be compared between synovial fibroblasts of wild type (WT) mice and those of transgenic mice of which a regulatory signaling protein is mutated. However, the optimal conditions for NF-kB activation needed to be determined first and a pilot experiment was performed. The latter was done using synovial fibroblasts of WT mice that were stimulated with several RA-associated cytokines such as TNF-a, IL-1b and IL-17. The activation of the NF-kB pathway was then assessed via Western blotting.

Analysis of the immunoblots for several signaling proteins showed no clear activation of the NF-

kB pathway for the chosen conditions. Although some degradation was observed for the signaling protein IkBa, an indication for NF-kB activation, it could not be confirmed by the presence of its phosphorylated form. It was not clear whether the detection of the phosphorylated proteins was unsuccessful or whether no activation had taken place. Overall, no conclusions could be made since there was no positive control to compare to. Therefore, the experiment needs to be repeated with a positive control and an optimized protocol for the detection of phosphorylated proteins.

 

Abstract Bachelor Project 3 FBT 2018-2019Role of hypoxia in rheumatoid arthritis

Rheumatoid arthritis (RA) is one of the most prevalent autoimmune condition that affects nearly 1 % of the world population. RA is an autoimmune disease that manifests itself by inflammation in various joints. Studies showed that the absence of oxygen plays an important role within the disease. Hypoxia is involved in different processes that also characterize RA such as inflammation, cartilage degradation and angiogenesis. The precise mechanism of hypoxia within RA is still to be defined. Recent studies have already revealed the importance of hypoxic genes that could be part of causing RA. In this thesis, ELISA and flow cytometry techniques were used to determine the function of specific immune cells. These techniques will give information about the cytokine secreting activity of cells: the number of inflammatory cytokines producing positive cells was measured by flow cytometry and the amount of secreted cytokine by ELISA. The immune cells and secretion capacity of inflammatory cytokines by these specific immune cells were analysed from wild type mice and specific hypoxic gene knock-out mice. The obtained results showed a possible link between the hypoxic genes and RA. Both experiments conducted to the same conclusion namely that the hypoxic gene could have an impact in developing RA. Further research is still needed to confirm this statement.

 

Abstract Bachelor project 2 2017-2018: The impact of biochemical stres on spondylarthritis

Spondyloarthritis (SpA) consists of a varied group of chronic immune-mediated diseases in which inflammation occurs mainly axially and/or peripherally, particularly in the larger joints of lower limbs, e.g. Achilles tendon in the ankle. The origin of the inflammation is the enthesis, the attachment site of tendon to bone, which can cause development of SpA in predisposed persons.

The aim of this research project is to optimize different techniques, necessary to investigate the role of biomechanical stress in the development of SpA and to further validate one of the mouse models used to study the effect of biomechanical stress in SpA.

One of the techniques used within the larger research project are running wheel and tail suspension, were mice are either subjected to higher or lower biomechanical load than in normal housing conditions. Until now we made use of voluntary running wheels combined with tail suspensions, however, certain transgene strains run significantly less compared to their wild littermate controls. Therefore, optimization of forced running wheel will be performed and evaluated A20myeloid-KO- and/or A20stromal-KO-mice, strains used in SpA-research.

Results showed that both strains perform well on the running band and that alleviation of biomechanical strain (tail suspension) seems to lower arthritis score in A20stromal-KO-mice. Chondrocyte cultures are optimized to be used in in vitro stretch-experiments that mimic the continuous force chondrocytes undergo at high impact sites, e.g. ankle joint.

Next to that, one of the mouse models used, A20stromal-KO, needs further validation to ensure that A20-deletion only happens in stromal cells of the joint and not in the hematopoietic compartment. For this, bone marrow transplants are optimized and western blot for the detection of A20 is tested. Both techniques still need further optimization.

 
Abstract bachelor project 1 2017-2018: The role of the gut in the development of spondyloarthritis

Spondyloarthritis (SpA) is a group of rheumatic diseases. Ankylosing spondylitis, as prototype, is an auto-inflammatory immune disease. Inflammation occurs in the spine and/or the larger joints of the lower body such as knees, ankle,…. In addition to arthritis, extra-articular symptoms can occur: acute anterior uveitis, psoriasis and inflammatory bowel disease (IBD). About 50% of the SpA patients develop subclinical intestinal inflammation and a part of the patients with Crohn’s disease develop arthritis. Clearly, there is a link between joint and gut inflammation, however, up till now no mechanistic explanation has been found.

The aim of this project is to optimise different techniques that will enable the research into this joint-gut axis. As a model for combined joint-gut inflammation, a human TNF-transgene mouse model will be used. These mice overexpress hTNF in the gut and as a result develop inflammation of the sacro-iliac joint. This model provides a nice research tool to study the anatomical and functional link between joint and gut. More specifically, how the lymphatic and immunological compartment might contribute to development of disease. 

In the first part of this study, digestion of sacro-iliac joints for cell isolation for flow cytometry was optimised. Since the use of different enzymes in the digestion mix might result in ‘shaving’ of markers, i.e. the digestion of markers necessary for antibodies to bind, this was tested on spleen cells from which we know certain cell populations have to be present. Afterwards, a try-out to compare transgene and wild type mice was performed.

To determine the presence, amount and anatomical variation of lymph vessels in transgene versus wild type mice,  optimization of immunohistochemically staining of Prox-1 and Lyve-1 and visualization of the mesentery was performed. Additionally, primers were designed to determine the relative gene expression of Flt4, Prox-1 and VEGF-C in different tissues.

To be sure hTNF is present on the protein level in the gut, digestion of gut samples and western blotting for hTNF was optimized.

Samenvatting eindwerk 2012-2013: Optimalisatie van het isoleren en in cultuur brengen van osteocyten
In het bot worden 3 types botcellen onderscheiden namelijk osteoblasten, osteoclasten en osteocyten. Osteoblasten en osteoclasten komen voor op het oppervlak van het bot die zorgen voor de aanmaak en afbraak van het bot. Osteocyten komen voor in de matrix van het bot en functioneren als mechanosensorische cellen. Bovendien kunnen osteocyten niet of moeilijk in vitro uit hun precursoren worden gedifferentieerd, dit in tegenstelling tot osteoblasten en osteoclasten, waardoor ze uit het bot moeten worden geïsoleerd. Doordat osteocyten diep in het bot gelegen zijn, zijn ze moeilijk te isoleren. Hierdoor zijn er meer behandelingen nodig voor het bot wat vaak nadeliger is voor de cellen.
Op de dienst reumatologie wordt in vitro onderzoek uitgevoerd op osteoblasten en osteoclasten. Het is echter duidelijk geworden dat het derde celtype, osteocyten, minstens een zo belangrijke rol hebben. Een combinatie van osteoblasten, osteoclasten en osteocyten in vitro zou een meer volledig overzicht kunnen geven op het botmetabolisme.
Het isoleren van de osteocyten uit botjes van muizen werd gebaseerd op bestaande protocols. De botjes worden geïsoleerd uit de achterpoten van een black 6 muis en vervolgens behandeld met een EDTA- en een collagenase oplossing: EDTA zorgt voor de ontkalking van het bot terwijl collagenase de peptideverbindingen verbreekt in collageen. De bekomen fracties bevatten cellen die vervolgens in cultuur worden gebracht in een CO2 incubator. Een totaal van 3 verschillende protocols werd uitgevoerd. Veranderingen in het protocol werden aangebracht aan de hand van de resultaten van het voorgaande protocol. Om vast te stellen of er wel degelijk osteocyten werden geïsoleerd, werd een immunofluorescentie controle kleuring uitgevoerd waarbij het primair antilichaam bindt aan osteocalcine, aanwezig in osteoblasten en osteocyten.
Er werden uiteindelijk, naarmate de optimalisatie van de protocols, meer cellen geïsoleerd maar er is nog verder onderzoek vereist voor de optimale isolatie en groeiomstandigheden van dit type cellen. Ook is er nog verdere optimalisatie nodig voor de controle kleuring om de zekerheid, dat er osteocyten aanwezig zijn, te vergroten.
 
Samenvatting eindwerk 2011-2012: Optimalisatie van primaire fibroblast celculturen en optimalisatie van virustiter bepaling bij infectie van insectcelculturen
Op de dienst reumatologie voert men verschillende onderzoeken uit met als voornaamste doel meer inzicht te verkrijgen in de auto-immuunziekte reumatoïde artritis. Fibroblasten zijn synoviale cellen die met dit doel worden bestudeerd. Hiervoor maakt men gebruik van het synovium afkomstig van de muis om de primaire cellen uit te kweken. Het synovium van de knie is een dun kapselvlies dat zich rond de beenderen van de knie bevindt en gevuld is met synoviaal vocht. Het synovium zal bij ontsteking gaan zwellen en hierdoor voor beschadiging van de gewrichten en het kraakbeen zorgen.
Omdat het synovium afkomstig van de muis klein is en het relatief lang duurt vooraleer een confluente primaire celcultuur wordt verkregen dient deze methode geoptimaliseerd te worden. Het synovium bestaat voornamelijk uit proteïnen zoals collageen en cellen zoals macrofagen en fibroblasten. 
Er worden verschillende methodes geprobeerd: variatie in het aantal stukjes synovia, een mechanische behandeling of door inwerking van enzymes.
Eerst en vooral is het belangrijk om het aantal proefdieren nodig voor dit experiment te bestuderen en indien mogelijk te verlagen. Dankzij de optimalisatie is het aantal benodigde stukjes synovia verlaagd van vier naar twee.  Een tweede mogelijkheid is om de stukjes synovia in te snijden met een scalpel, zodat het oppervlak wordt vergroot. Deze methode lijkt echter niet beter dan de methode die vroeger werd gebruikt.
Een andere mogelijkheid is een enzymatische afbraak. De enzymes, namelijk dispase, hyaluronidase, collagenase en trypsine, zullen de proteïnen waaruit het synovium hoofdzakelijk bestaat, afbreken. De methode met collagenase is de beste methode, waarbij na één week een confluente cultuur wordt verkregen die kan worden uitgesplitst naar een T-25.
Het tweede deel van deze bachelorproef omvat een optimalisatie van de virustiter bepaling bij infectie van insectcelculturen.
Het is van belang om optimaal de virustiter te kunnen bepalen om voldoende expressie van het CD1d eiwit te hebben. Dit eiwit is belangrijk voor het kleuren van de NKT-cellen, omdat er onderzoek wordt gedaan naar de rol van deze cellen in RA.
Het eiwit wordt via het Baculovirus in een insectcellijn geproduceerd. Van dit eiwit kan een tetrameer gemaakt worden dat wordt geladen en geactiveerd. Het geheel zal zich dan met de T-cel receptor van de NKT-cel binden, waardoor de NKT-cel zichtbaar wordt met flowcytometrie.
De virustiter kan worden bepaald met behulp van twee methodes die elk hun voor- en nadelen hebben. De plaque assay is eenvoudig uit te voeren, maar vergt heel wat tijd en de aflezing is niet zo gemakkelijk. Anderzijds is er de BacPak Baculovirus Titer Kit die veel sneller is, maar de kostprijs als nadeel heeft.
Er moet dus een methode worden gevonden die zowel tijds- en kostprijs efficiënt is.
Dit kan door de methode van de kit te gebruiken, maar de producten te vervangen door eigen producten die worden aangekocht. De methode van de kit heeft goede resultaten. Echter is de methode met eigen producten nog niet volledig geoptimaliseerd. Een werkzaam primair en secundair antilichaam werden gevonden, waardoor de kostprijs al aanzienlijk is gedaald. De substraten TMB en AEC alsook een 546- en FITC-kleuring die werden gebruikt geven echter niet de gewenste clusters waardoor de titerbepaling niet mogelijk is. Er moet dus in de toekomst nog gezocht worden naar een goed substraat of een andere methode waarbij de titer kan bepaald worden.
Samenvatting eindwerk 2005-2006: De TNF DAREmuis histologisch bekeken: een model voor inflammatoir darmlijden en reumatoïde artritis?
 
De TNF∆ARE/+  muis is genetisch veranderd zodat het mRNA van TNF een grotere stabiliteit heeft.  Hierdoor krijgt men een overproductie van TNF.  Deze muis zou model staan voor inflammatoir darmlijden en reumatoïde artritis. 
Verschillende stukken weefsel (ileum, voeten, enkels en ruggen) worden in histologische coupes gebracht en versneden aan de hand van een microtoom.  De verschillende preparaten worden gekleurd met de hematoxyline-eosine kleuring.  Wanneer de ileums bestudeerd worden, ziet men verschillende gradaties in villi-aantasting en in inflammatoir infiltraat.  Via deze gradaties is een score systeem geconstrueerd.
Aan de hand van de voeten, enkels en rug kan men de gewrichten bestuderen.  Deze worden gekleurd met de hematoxyline-eosine kleuring en de safranine kleuring.  Uit de waarnemingen van beide kleuringen kan men afleiden of deze verschijnselen vertonen van reumatoïde artritis. 
Uit de histologische analyse van de verschillende gewrichten kan men besluiten dat de TNF∆ARE  muis niet echt model staat voor reumatoïde artritis maar eerder voor spondylitis ankylosans.  

Address

De Pintelaan 185
9000 Gent
Belgium
De Pintelaan 185
9000 Gent
Belgium

Contacts

Prof. Dr. D. Elewaut
09/3322240
Dirk.Elewaut@UGent.be
Julie Coudenys
Renée Van der Cruyssen
Renee.VanderCruyssen@UGent.be
Elisabeth Gilis
Srinath Govindarajan
Emilie Dumas
emilie.dumas@ugent.be
Zoekopdracht
Klassiek
Via Map