Pages
VIB – UG, Inflammation Research Center
Contact details
Traineeship proposition
Abstract
Testimony
Admin
Stageonderwerp 2012-2013: Validatie van RIP1 interactoren en substraten tijdens necrotische celdood
Uit voorgaand onderzoek wereden een aantal potentiële interctoren van Receptor Interacting Kinase 1 (RIPK1) bekomen. Dit eiwit speelt een cruciale rol in dood-receptor gemedieerde celdood en een beter begrip van het interactie-netwerk en de substraten van RIPK1 kunnen bijgevolg bijdragen tot de ontdekking van nieuwe therapeutische targets met toepassingsgebieden in hersen/hartinfarcten, neurodegeneratie en kankerbestrijding. Het is de bedoeling om deze RIPK1 interactoren te valideren op interactie-niveau, alsook na te gaan of ze een rol spelen in de modulatie van necrotische en apoptotische celdood (cellulair niveau).
Activiteiten door te student uit te voeren kunnen bestaan uit (maar is afhankelijk van voortgang en verdeling van het project): cel-en weefselkweek; DNA-cloneringstechnieken; co-immunoprecipitaties; western blot; knockdown experimenten (siRNA, shRNA); RT-PCR en q-PCR
Stageonderwerp 2009-2010
De stage past in een project waarin we mechanistisch inzicht willen verwerven in de selectieve inductie van de doelwitgenen van een evolutionair sterk geconserveerde signaaltransductieweg, de canonieke Wnt/β-catenine signaalweg. Bijzonder opmerkelijk is dat een aantal belangrijke signaaltransductiewegen (zoals de FGF, TGFβ/BMP, Hedgehog en Notch signaalwegen) herhaaldelijk worden hergebruikt tijdens de embryonale ontwikkeling, telkens voor verschillende inductieve processen (bv. specificatie van de dorsale as, polarisatie van de neurale buis, vorming ledematen, tanden, ontwikkeling van de long, …). Dit impliceert dat de activatie van deze signaalwegen telkens een andere transcriptionele respons genereert afhankelijk van de plaats (weefsel of orgaan) en (ontwikkelings)tijdstip. Dergelijke spatiotemporele differentiële respons op een gelijkaardig signaal kunnen we enerzijds verklaren door combinatorische regulatie - via de gecoördineerde input van verschillende transcriptiefactoren en signaalwegen, of anderzijds via epigenetische regulatiemechanismen (chromatinestructuur, DNA methylatie en microRNA’s). Specifiek willen we nagaan welke van deze alternatieve mechanismen betrokken zijn bij de spatiotemporele respons op de Wnt/β-catenine signaalweg.
Gedurende de laatste jaren werden door ons experimentele modellen ontwikkeld in het organisme Xenopus die ons toelaten om voor verschillende organen de primaire doelwitgenen te identificeren die worden geïnduceerd door de activatie van de Wnt/β-catenine signaalweg. We zullen nagaan hoe de orgaan-specifieke expressie van deze genen wordt gereguleerd tijdens de embryonale ontwikkeling.
Concreet houdt de stage in dat voor verschillende van de door ons geïdentificeerde genen moet worden nagegaan of ze daadwerkelijk directe targets zijn van de Wnt signaalweg. Hiertoe dienen we in eerste instantie hun promoter regio’s te onderzoeken voor de aanwezigheid van geconserveerde transcriptiefactor bindingsplaatsen (TFBS’s). Dit zal gebeuren via in silico analyse, voornamelijk gebruik makend van de programma’s TransFAC en CONTRA (=dry-lab). Tegelijkertijd zullen de promoterregio’s van deze genen ook onderzocht worden via chromatine immunoprecipitatie (= wet-lab), om verder te onderzoeken of de geïdentificeerde genen al dan niet directe doelwitten zijn van de Wnt signaalweg. Tenslotte willen we ook nog in silico nagaan of de promoter regio’s van genen die enkel in een bepaald orgaan worden geïnduceerd door de Wnt signaalweg, gemeenschappelijke kenmerken (bv, gelijkaardige TFBS’s) bevatten.
Stageonderwerp 2005-2006
Analyse van de rol van het cadherine/catenine adhesiecomplex in de embryonale ontwikkeling
Het project maakt gebruik van embryo’s van de Zuid-Afrikaanse klauwkikker (Xenopus laevis) voor de bestudering van de vroege embryonale ontwikkeling. Omwille van zijn externe ontwikkeling, zijn robuustheid en zijn eenvoudige manipuleerbaarheid, vormt dit organisme al jaren één van de werkpaarden van de ontwikkelingsbiologie in vertebraten. Concreet willen we in Xenopus nagaan wat de embryonale rol is van specifieke cel-cel adhesiemoleculen, meer bepaald tijdens bepaalde morfogenetische processen die plaatsgrijpen tijdens de ontwikkeling. Hier denken we bijvoorbeeld aan de migratie van primordiale kiemcellen of het uitgroeien van neuronen. Dit zullen we doen door deze adhesiemoleculen specifiek te onderdrukken via de injectie van Morfolino antisense nucleotiden waarna de fenotypes worden bestudeerd. Dit moet ons meer inzicht bieden in de biologische functie van deze adhesiemoleculen en kan eveneens informatie opleveren in het ontstaan van bepaalde menselijke ziektes.
Technieken die aan bod zullen komen : DNA kloneringen, gelelectroforese, eiwitanalyse (Western blotting, immunohistochemie), histologie, RNA synthese, fluorescentiemicroscopie...
Abstract 2018-2019: Improvement of a platform to manage frozen cells and cell lines by implementing visualisation features
Cells derived from different origins and species are used in certain experiments. To enable longterm storage, cells can be transferred into vials to allow cryopreservation in liquid nitrogen containers. CellManager is a webtool which enables easy management and tracking of primary cells and cell-line collections of the host institute. The tool has an easy to use interface for lab technicians and scientists to deposit, store and order vials with certain cells. The tool serves as a communication between the scientists and the Tissue Culture Core facility (TC) who manages the liquid nitrogen containers. Next to the storage features of the tool, it also serves as an easy way to view and import information about cell-lines and to track down ancestral information. In the webtool, scientists can deposit a certain amount of vials of an existing or new cell-line. Before the actual storage, all cells should be contamination free before storage, so they can be used for new experiments when ordering cells. Therefore all deposit requests are checked for contamination of mycoplasma bacteria and bacteria that grow in tryptose soya broth (TSB). If these sterility tests are negative, the vials are safe to be stored in the liquid nitrogen containers. After storage, scientists can order certain vials of a cell-line, which is handled by the TC core. Finding a suitable location is not yet automated. The container managers now pick a random free spot to store vials. This does not take into account that there might be cells of the same cell-line already present in the same container. Spreading cell-lines over different containers is preferable to reduce the chance of losing a cell-line in case of an unexpected breakdown. This is where a prediction algorithm comes into play. This algorithm will suggest a suitable storage location taking into account the different parameters. To further improve the job of the TC core, a visualisation of all locations within each liquid nitrogen barrel and each ultra-low temperature freezer (ULT) was added. Every container has its own layout in which vials can be stored. With both the visualisation and prediction algorithm, it will be more convenient to find the most optimal storage location for certain cells within different containers.
Samenvatting eindwerk 2012-2013: Identificatie van nieuwe celdood mediatoren via RNAi
In het laboratorium voor Moleculaire Signaaltransductie in Celdood van het Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB) en Universiteit Gent, wordt onderzoek gevoerd naar de verschillende signaaltransductiewegen of 'pathways' die tot geprogrammeerde celdood leiden. Door meer inzicht te krijgen in de apoptose en necrose ‘pathway’, hoopt men tot nieuwe ontwikkelingen te komen voor de behandeling van verschillende aandoeningen (kanker, hart- en herseninfarcten, de ziekte van Crohn…).
Bij geprogrammeerde celdood zorgt een stimulus voor een signaalcascade, die leidt tot biochemische en moleculaire reacties op diverse subcellulaire niveaus. Gedurende dit project probeert men mediatoren die betrokken zijn bij apoptose en/of necroptose te identificeren d.m.v. ‘knock-down’ met RNAi (‘RNA interference’). RNAi ‘gene silencing’ vereist hierbij de expressie van specifieke microRNA (miRNA) in L929 muis fibroblasten. Deze RNA-fragmenten binden op het mRNA van een specifiek gen, waardoor de translatie ervan onderdrukt wordt.
Om nieuwe mediatoren aan te tonen m.b.v. RNAi, moet men een idee hebben van de genen die in aanmerking komen als mediatoren. Deze stap, waarbij men gebruik maakte van ‘fosfoproteomics’ resultaten, ging vooraf aan dit project. Peptiden met het gewenste fosforylatieprofiel, meerbepaald gefosforyleerd tijdens TNF-geïnduceerde necrose, stroomafwaarts van Receptor-Interacting Protein Kinase’ 1 (RIPK1), werden geselecteerd. De uitkomsten hiervan konden vervolgens vergeleken worden met de celdood-databank, wat resulteerde in een reeks genen van eiwitten die mogelijks een invloed hebben op vroege en/late necrose of apoptose. Van de 60 genen worden er gedurende deze bachelorproef vijf celdood genen verder onderzocht tot op het celdood-niveau.
De integratie van miRNA coderende sequenties in het genomisch DNA van zoogdiercellen is mogelijk a.d.h.v. lentivirale overdracht. Voorafgaand hieraan oogst men, voor elk uit te schakelen gen, een virus dat codeert voor een welbepaald miRNA. De vereiste lentivirussen worden in Human Embryonic Kidney (HEK) 293T cellen geproduceerd, nadat men deze met drie lentivirale plasmiden heeft getransfecteerd: een ‘packaging’ plasmide, een enveloppe plasmide en een lentivirale expressie vector (pLenti6 expressie vector).
De pLenti6 expressie vector wordt aangemaakt door opeenvolgend een T4-ligatiereactie en een Gateway LR reactie uit te voeren. Hiervoor worden primers die complementair zijn aan een specifiek mRNA, als dubbelstrengig DNA (dsDNA) geligeerd in de miRNA expressie cassette van een ‘entry clone’ (pENTR). Deze heeft de functie van ‘shuttle-vector’, om de cassette na ligatie van het dsDNA oligo, over te brengen naar een lentiviraal expressie plasmide (pLenti6 DEST). Deze tweede stap is mogelijk a.d.h.v. het ‘Gateway®Technology’ recombinatiesysteem.
Zowel na de ligatie- als na de recombinatiereactie vindt er een transformatie en antibioticaselectie plaats, zodat men over voldoende DNA beschikt om een controle digest uit te voeren. Daarnaast is er ook een controle-PCR om na te gaan of de mRNA specifieke primers in het plasmide zijn opgenomen. DNA-gelelektroforese van het digest en de PCR-reactie hoort te resulteren in een verwacht bandenpatroon. Stalen waarvoor dit het geval is, worden opgestuurd voor sequenering. Resultaten geven aan dat de cassette in alle vectorplasmiden is opgenomen, met uitzondering van deze met dsDNA oligo 8.
De correct gekloneerde pLenti6 expressie vectoren worden daarna gebruikt voor transfectie van HEK 293T cellen. Na twee dagen bevat het medium op de cellen voldoende lentivirale partikels om de doelcellen te transduceren. GFP-productie en antibioticaselectie verzekeren dat het construct na transductie in het cellulair genoom is geïncorporeerd.
Toevoegen van TNF en FASL, stimuleert vervolgens celsterfte, en maakt het mogelijk om het effect van ‘knock-down’ op necrose, apoptose en NF-kB-activatie na te gaan. De hoeveelheid celdood wordt bepaald d.m.v. fluorescentiemeting met de ‘high-content analyzer’ (‘BD pathway Bioimaging system 995®’) en een multi-mode microplaataflezer (FLUOstar Omega®). Grafische uiteenzetting van de procentuele verhouding gemeten celdood t.o.v. maximale celdood, toont hierbij aan dat ‘knock-down’ met construct 5 celsterfte tot 25% bevordert. Dit kan erop wijzen dat het gen celdood in normale cellen vertraagt of in grotere mate geëxpresseerd wordt in tumorcellen. Verder in vitro en in vivo onderzoek zal duidelijk maken of inzichten kunnen helpen in de inhibitie van een neoplasma.
Samenvatting eindwerk 2011-2012:
Generatie van Pichia pastoris expressiefactoren voor proteïneproductie en glyco-engineering
Wegens confidentialiteit kan de samenvatting niet gepubliceerd worden.
Samenvatting eindwerk 2009-2010: Onderzoek naar de primaire doelwitgenen van de Wnt/β-catenine signaalweg met behulp van in silico promotor analyse en expressiestudies in Xenopus
De Wnt/β-catenine signaalweg speelt een grote rol tijdens de dierlijke embryonale ontwikkeling en tijdens de botontwikkeling. Als een Wnt ligand bindt aan de Frizzled receptor wordt β-catenine geaccumuleerd en gaat het de kern binnen. Daar bindt het met leden van de T cel factor (TCF) waardoor een transcriptiecomplex gevormd wordt. Dit complex bindt op specifieke transcriptiefactor bindingsplaatsen op de promotor van de doelwitgenen waardoor de transcriptie gestart wordt en de Wnt doelwitgenen worden afgeschreven. Onderzoek naar doelwitgenen van deze pathway wordt uitgevoerd met Xenopus als modelorganisme. In vorige projecten werden reeds constructen gemaakt om de Wnt signalisatie in bepaalde Xenopus embryo’s te activeren en in andere te represseren. Van deze geactiveerde en gerepresseerde embryo’s wordt het hoofd afgesneden, daarvan RNA geëxtraheerd en uiteindelijk wordt dit RNA onderworpen aan micro-array analyse. Deze techniek geeft een hele lijst mogelijke primaire doelwitgenen. Door het construeren van transgene Xenopus tropicalis embryo’s werd aangetoond dat de Wnt pathway actief is in het hoofd, voornamelijk in de middenhersenen, de achterhersenen, het oog, het oorblaasje en de kieuwbogen. Hierdoor werd in dit project enkel verder aandacht besteed aan genen die expressie vertonen in het hoofd.
In het eerste deel van dit project wordt in silico gecontroleerd of die genen primaire en geen secundaire doelwitgenen zijn. Dit wordt onderzocht met het softwareprogramma ConTra (Conserved Transcriptionfactor bindingsites). Dit programma gaat na of er transcriptiefactor bindingsplaatsen (TFBSs) voor LEF/TCF te vinden zijn. 34% van de lijst met mogelijke primaire doelwitgenen bevat LEF/TCF bindingsplaatsen. Twee genen tonen zelfs 8 bindingsplaatsen, AKAP2 en FGF6. 58 genen (66%) worden niet verder onderzocht. Deze genen hebben namelijk geen of weinig LEF/TCF bindingsplaatsen binnen 2 kb ten opzichte van de transcriptie start site (TSS). Dit hoeft niet te betekenen dat deze geen bindingsplaatsen hebben. Deze kunnen zich namelijk verder upstream of downstream bevinden. De bindingsplaatsen kunnen ook in de intronen voorkomen, waardoor deze door ConTra niet gevonden worden. Ook wordt meer gekeken naar genen die geconserveerde TFBSs hebben die binnen 800-1000 bp van de transcriptie start site liggen. Onderzoek wijst namelijk uit dat de meeste functionele TFBSs in die regio geconcentreerd zijn. Voor de genen met veel TFBSs in veel species (34%) wordt de plaats van de expressie gezocht met behulp van PubMed. Dit is een zoekrobot die nagaat welke genen reeds bestudeerd werden en waar de expressie voorkomt. Genen die expressie vertonen in het hoofd worden geselecteerd voor verder onderzoek. INHIBIN BETA A vertoont bijvoorbeeld expressie in de cranio-faciale regio. Ook FLRT1-, ACY1-, AKAP2-, CAMK4-expressie komt voor in de hersenen. Uiteindelijk worden vijf genen door hun transcriptiefactor bindingsplaatsen, hun expressie en hun wetenschappelijke achtergrond uitgekozen: ambn, CAMK4, AKAP2, IRF6 en SLC19A2.
Het tweede deel omvat de expressiestudies. Hierbij wordt verder gecontroleerd of de uitgekozen genen primaire doelwitgenen zijn via klonering en in situ hybridisatie. De activerings- en repressieconstructen worden in de Xenopus embryo’s bij stadium 22 geïnjecteerd. Daarna worden de embryo’s behandeld met dexamethasone (Dex). Omdat de constructen gekoppeld zijn aan het hormoonbindend domein van de glucocorticoïde receptor (GR), worden enkel bij het toevoegen van Dex functioneel actieve eiwitten gemaakt. De embryo’s worden dan gefixeerd bij stadium 26. Na in situ hybridisatie kunnen de Wnt-geactiveerde, Wnt-gerepresseerde en niet-geïnjecteerde embryo’s met elkaar vergeleken worden. De Wnt-geactiveerde embryo’s zouden een sterker signaal moeten vertonen dan de niet-geïnjecteerde embryo’s. De Wnt-gerepresseerde embryo’s zouden op hun beurt een zwakker signaal moeten vertonen. Hierdoor kan bepaald worden of de genen in kwestie doelwitgenen zijn. Voor alle vijf de uitgekozen genen wordt deze procedure overlopen. Uiteindelijk wordt de in situ hybridisatie enkel met IRF6 en CAMK4 uitgevoerd. SLC19A2 vertoont na het kloneren namelijk geen juiste DNA fragmenten. Dit zou kunnen betekenen dat de primer niet optimaal was of dat de embryo’s in stadium 26 geen SLC19A2-expressie vertonen. Dit is ook het geval voor ambn. Bij AKAP2 komt de sequentie van de kloon en die van het gen zelf niet overeen. De in situ hybridisatie toont voor de IRF6 en CAMK4 probes geen signaal. Dit betekent niet dat deze genen geen expressie vertonen. Er werd door technische problemen met te weinig probes gewerkt om een duidelijk signaal te kunnen waarnemen. Deze experimenten zullen daarom in de nabije toekomst opnieuw uitgevoerd worden.
Samenvatting eindwerk 2005-2006: Onderzoek naar de rol van p0071 in de vroege ontwikkeling van Xenopus
In dit eindwerk staat het onderzoek naar de rol en de signalisatiefuncties van het Xp0071 eiwit in de vorming van intercellulaire-adhesie complexen centraal. Ontregeling van bepaalde componenten van deze intercellulaire-adhesie complexen geven vaak aanleiding tot de metastasevorming bij tumoren. p0071 is waarschijnlijk een belangrijk eiwit voor de vorming van adhesie complexen omdat het in twee typen van adhesie complexen aangetroffen wordt, namelijk in de adherens junctie en in de desmosomen. Tijdens dit project wordt het modelorganisme Xenopus laevis, de Zuid Afrikaanse kikker gebruikt. De bedoeling van dit onderzoek is op een gerichte manier experimenten uit te voeren om zo de functie van p0071 te achterhalen.
Wanneer men de functie van een eiwit bestudeert kan men twee behandelingen toepassen, namelijk de ‘gain-of-function’ (overexpressie van het eiwit) of de ‘loss-of-function’ (onderdrukking van het eiwit) aanpak. Het eerste deel van de experimenten wordt geconcerteerd op de onderdrukking van Xp0071 onderzoek. De onderdrukking van Xp0071 door een morfolino injectie wordt gebruikt om de mogelijke noodzaak van Xp0071 in de vorming van de neuronale vertakkingen en in de nierontwikkeling te onderzoeken. De immunokleuring vertoont geen veranderingen bij de vertakkingen van de neuronen door Xp0071 onderdrukking. Hetzelfde effect wordt aangetroffen bij de nierontwikkeling, er ontstaan geen fenotypische veranderingen. Verder onderzoek toont ook aan dat Xp0071 betrokken is bij de regulatie van het expressieniveau van het XARVCF eiwit en waarschijnlijk niet betrokken is bij het expressieniveau van XE-cadherine, XN-cadherine en Xp120ctn.
In het tweede deel van het onderzoek wordt de transgenese techniek gebruikt om de visualisatie van de neuronen te verkrijgen. Hiertoe wordt het N-terminale deel van Xp0071 aan GFP gekoppeld en onder controle gebracht van een gerichte promotor (neurale-β-tubuline) om later een transgene lijn te kunnen opstellen. Deze resultaten tonen aan dat Xp0071 niet noodzakelijk is voor de ontwikkeling van de neuronen en de nieren. Mogelijks wordt de functie van p0071 overgenomen door een ander lid van de p120ctn subfamilie. De transgene lijn wordt met succes opgesteld en vormt een platform voor toekomstig onderzoek op neuronaal weefsel.
Address
|
Technologiepark 927
9820 Gent
Belgium |
Contacts
|
Traineeship supervisor
Grootjans Sasker
|
|
Traineeship supervisor
Arne Soete
|