UGent Faculteit Diergeneeskunde faculteit, vakgroep farmacologie, toxicologie en biochemie, onderzoeksgroep biochemie
Contact details
Traineeship proposition
Abstract
Testimony
Admin
Abstract bachelorproef 1 2016-2017: Flowcytometrische viabiliteitsbepaling van Esherichia coli na blootstelling aan biociden en antibiotica
Biocides are biochemistry products used for the prevention of animal sickness and to control zoonosis. There are indications that the usage not only can cause biocide resistance but also rises the chance to develop antibiotic resistance. With a recent optimized flowcytometry method it is possible to determine the viability of E. coli based on membrane integrity and potential after a dual fluorescent DIBAC(4)3 / PI staining. Being able to measure the viable but non culturable bacteria, flowcytometry is a huge advantage to the standard plate-count method.
In this study the new method will be used in a routine experiment of E. coli strains, isolated from chicken and pigg company’s and will evaluate the effect of biocide on antibiotic resistence.
The first goal of the research was to determine the BKC concentration to be used in the experiment. A BKC concentration of 0.00675 g/l was chosen because a minimal effect on the viability and a remaining 7 log bacteria concentration was observed and is a good basal start for a second incubation with antibiotics to determine susceptibility.
The second objective was to determine the viability of two reference strains (ATCC25922 and MB4369) and four field isolates (VP11, KQ26, KL6 and VA57). The reference strains showed an increased resistence after a BKC incubation.
For each field isolate the amount of living bacteria based on plate count increased which indicates an increased resistence after a BKC treatment. The percentages of the DIBAC+/PI-, presumed VBNC bacteria show a variable effect, dependent of the field isolate and the antibiotic concentration. In general an increase of VBNC is seen after biocide treatment, what indicates that this subpopulation is part of the resistance mechanism of the bacteria. This subpopulation should be further identified using e.g. efflux pump assay and PCR as described in literature of Salmonella exposure to biocide challenge.
In general the count-plate method and the flowcytometry method are complementary to each other. The data from both methods are necessary to evaluate the effect from BKC on antibiotic resistence.
Abstract bachelorproef 2 2016-2017: Optimization of PCR with specific primers for SNP detection in fire salamanders
Wegens confidentialiteit kan de samenvatting niet gepubliceerd worden.
Samenvatting eindwerk 2014-2015: Screening on lethal chytridiomycosis through quantitative PCR on wild living amphibians
Chytridiomycosis is an infection caused by two different fungi, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) or Batrachochytrium salamandrivorans (Bs). Both fungal species infect amphibians. Bs is more isolated and characterized from salamanders and Bd from frogs / toads.
About ten years ago Bd was isolated for the first time from frog skin and described. This fungus causes epidermal hyperplasia and hyperkeratosis of the amphibian skin. In 2012, another related species was discovered, the salamander-infecting fungus Bs. This fungus causes especially deep skin ulcers.
Both fungi interfere with the physiological functioning of the amphibian skin, whereby they eventually cause in most cases, death of the amphibian. The fast and easy spread of these fungi lately induces a large number of infections. There is also observing a huge decline and even extinction of some amphibian populations. Therefore chytridiomycose is one of the greatest threats to biodiversity.
Nowadays, it is important to screen as many as possible amphibians both living and dead, of the presence of these fungi. Thanks to this kind of screening more information can be discovered about the lethal chytridiomycosis. Such screenings are done through quantitative PCR. At this point, it can’t be avoided that these fungi cause extinction of some wild amphibian populations.
This screening consisted of a sampling, DNA extraction, preparation for the final qPCR and the qPCR. The different screenings were performed according to different sampling methods and DNA extractions.
First, 28 wild yellow-bellied toads were found during different periods screened on the Bd fungus. This has shown that there was only one toad positive. However, it was in fact a small dose, and it was not certain whether the toad was recently infected or whether it was already in a recovery phase. The toad wasn’t found later, there is no certainty that this animal has survived the infection. The next screenings were performed on amphibians that were found in the wild death. These screenings are especially important to quickly detect an infection outbreak. Both dead newt and several ordinary toads were screened. None of these animals had chytridiomycose as cause of death.
These screenings could clarify why and how a chytridiomycosis outbreak takes place specifically on these locations. Also changes in infection status from some animals can be checked. Because of this, a solution to this problem could eventually be found on a long-term perspective.
Samenvatting eindwerk 2012-2013: Optimalisatie van de benodigde technieken voor het bestuderen van interacties tussen alfaherpesvirussen en pDC’s
De familie van de alphaherpesvirussen bevat drie humane pathogenen, nl. Herpes Simplex type 1 (koortsblaasjes), Herpes Simplex type 2 (genitale laesies) en Varicella Zoster Virus (windpokken). Bij kinderen en mensen met een verlaagde immuniteit kunnen deze herpesinfecties naast hun klinisch milde symptomen zeer ernstige ziektebeelden veroorzaken zoals keratitis, encefalitisch en mengingitis.
Om deze ernstige ziektebeelden te voorkomen is een sterke immuunrespons, nl. de productie van Type I-interferon (TI-IFN) door de gastheer cruciaal. Plasmacytoide dendritische cellen (pDC’s) kunnen zeer snel na infectie van de gastheer enorme hoeveelheden TI-IFN produceren. In de literatuur werd al aangetoond dat Herpesvirussen, d.m.v. hun DNA, de productie van TI-IFN in pDC’s kunnen activeren. Daarnaast zijn er aanwijzingen dat er ook een DNA-onafhankelijke virale inductie van TI-IFN-productie aanwezig is.
Het doel van deze bachelorproef was het optimaliseren van verscheidene technieken die onderzoek naar deze DNA-onafhankelijk activatie moeten mogelijk maken. Namelijk het isoleren van pDC’s uit bloed, de isolatie van herpesvirussen uit celcultuur en de optimalisatie van een TI-IFN-ELISA.
Eerst werd een IFN-α ELISA opgesteld. Hiervoor werden in eerste instantie de gewenste antistoffen aangemaakt: het opgroeien van de hybridoma’s, het verzamelen van het supernatans en tot slot het opzuiveren van de antilichamen.
De ELISA werd geoptimaliseerd met behulp van recombinant interferon alfa. Verschillende condities (antistofconcentratie, tijd, temperatuur) werden getest en geëvalueerd op basis van hun gevoeligheid. De succesvol bekomen ELISA heeft een gevoeligheid van 0,1 U/ml.
Om pDC’s te verkrijgen worden in eerste instantie perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC’s) opgezuiverd uit varkensbloed. Dit gebeurde met behulp van een densiteitscentrifugatie op Lymfoprep. Hierdoor werden PBMC’s van erythrocyten en granulocyten gescheiden. Daar pDC’s slechts 0,2% van de totale PBMC-populatie uitmaken, moeten deze nog verder aangerijkt worden m.b.v. magnetische cell scheiding (MACS). Magnetische partikels werden gebonden aan cellen met behulp van antilichamen gericht tegen specifieke oppervlakte-antigenen. Deze worden vervolgens in een magnetisch veld gebracht om zo twee fracties te scheiden. Verscheidene combinaties van antilichamen werden uitgetest en geanalyseerd op basis van hun functionele activiteit m.b.v. de eerder opgestelde ELISA. Er werd besloten dat een negatieve selectie op basis van CD14 (een merker van monocyten), gevolgd door een positieve selectie op basis van CD172a (een myeloïde merker) de efficiëntste opzuiveringsmethode is.
Herpesvirussen produceren twee soorten viruspartikels: enerzijds infectieuze H-partikels en anderzijds L-partikels die geen nucleokapsied bevatten. Om de DNA-onafhankelijke virale inductie van pDC’s te bestuderen kunnen deze L-partikels een zeer waardevol hulpmiddel zijn. Daar H- en L-partikels een verschillende densiteit hebben, werden ze gescheiden d.m.v. densiteitscentrifugatie. Verschillende substraten en concentraties voor het maken van de densiteitsgradiënt werden getest. Een continue gradiënt bestaande uit Iodixanol gaf hierbij de meest veelbelovende resultaten, alhoewel er nog geen zuivere L-partikel populatie verkregen werd.
Tot slot werden de eerste experimenten voor virus-afhankelijke productie van TI-IFN door pDC’s uitgevoerd. Hierbij werden de optimale cel- en virusconcentraties bepaald om een maximale interferonrespons te induceren. Deze experimenten zullen later een vervolg krijgen met de opgezuiverde H- en L-partikels.
Samenvatting eindwerk 2008-2009: Optimalisatie van een in vitro model voor equine infectieuze artritis
Dit project handelde over het optimaliseren van een in vitro model voor infectieuze artritis bij paarden. Gewrichtsaandoeningen bij paarden is een vaakvoorkomend en één van de voornaamste oorzaken van manken en vroegtijdig stopzetten van de sportcarrière.
Belangrijk bij infectieuze artritis is het stellen van een snelle diagnose van primordiaal belang. Uitstellen van therapie leidt immers tot een snelle progressie van de ziekte, waarbij de kans op permanent functieverlies en sterfte door sepsis vergroot.
Er is daarom nood aan een in vitro model voor de gecontroleerde studie van infectieuze artritis. Er bestaat nog geen model voor deze gewrichtsaandoening dat de evaluatie van kandidaat biomerkers mogelijk maakt in contrast tot de verschillende beschreven in vitro modellen voor niet-infectieuze osteoartritis. Daarom werd er aan de hand van verschillende bronnen een protocol ontwikkeld voor het maken van een in vitro model voor infectieuze artritis. Tijdens de ontwikkeling zijn er verschillende problemen opgetreden waaronder dat gebleken is dat het steriel afnemen van weefsel moeilijk is.
Daarnaast moeten de biomerkers geoptimaliseerd worden voor een betere en meer eenvoudige differentiatie tussen infectieuze en niet-infectieuze artritis. In dit project wordt specifiek de viabiliteit van neutrofielen en de bepaling van het gehalte myeloperoxidase als biomerker gebruikt. Aangezien het opstarten van het in vitro model nogal intensief en veel voorbereiding kost, en de biomerkers nog niet volledig geoptimaliseerd zijn, werd er gekozen om het opstarten van het in vitro model nog wat uit te stellen.
Tijdens de optimalisatie van de biomerker viabiliteit van neutrofielen, bleek de viabiliteit van de neutrofielen te dalen, daarom werden de samenstellingen van de verschillende buffers aangepast. De verschillende aanpassingen resulteerden niet in een betere viabiliteit. De wasbuffer werd vervangen door DMEM waarna men zag dat de viabiliteit terug steeg na een overnachtincubatie. Daarna werden er enkele experimenten uitgevoerd waarin PBS met DMEM werd vergeleken. DMEM gaf iedere keer mooie viabiliteitsresultaten, waardoor deze nu als wasbuffer wordt gebruikt in het protocol bij de isolatie van neutrofielen.
De optimalisatie van de myeloperoxidase bij neutrofielen verliepen ook niet van een leien dak, normaal reageren de antilichamen enkel op myeloperoxidase vanuit de neutrofielen. Maar men zag dat de bacteriën ook myeloperoxidase positief reageerden, daarom werden verschillende experimenten uitgevoerd om te onderzoeken hoe dit kwam. Men dacht eerst dat de bacteriën myeloperoxidase op hun celwand binden na contact met neutrofielen. Dit bleek echter niet zo te zijn. Ze bevatten Fc receptoren op hun celwand waardoor ze net anti MPO IgG kunnen binden. Hierdoor dacht men dus dat bacteriën myeloperoxidase positief reageerden. In het project wordt geprobeerd de Fc receptoren te vernietigen waardoor de bacteriën Alexa Fluor 488 negatief (fluorochroom secundair antilichaam) zouden reageren wanneer ze geïncubeerd worden met het anti MPO IgG. Tot nog toe geeft dit al een positief resultaat gegeven.
Wanneer de analysemethoden van beide biomerkers geoptimaliseerd zijn, kan men zich concentreren op het optimaliseren van het in vitro model. Later kunnen deze biomerkers dan hopelijks dagdagelijks toegepast worden voor de diagnose tussen infectieuze en niet-infectieuze artritis.
Address
|
Salisburrylaan 133
9820 Merelbeke
Belgium |
Contacts
|
Traineeship supervisor
Prof. dr. Evelyne Meyer
09/264.73.29. evelyne.meyer@ugent.be |
|
Traineeship supervisor
Kristel Demeyere
+32 9 264 73 55 kristel.demeyere@ugent.be |