Pages
UG, vakgroep biologie, Laboratorium voor verouderingsfysiologie en moleculaire evolutie
Contact details
Traineeship proposition
Abstract
Testimony
Admin
Stageonderwerp 2006-2007
In het genoom van de nematode C. elegans werden meer dan 30 verschillende globines geïdentificeerd dmv computationeel databank onderzoek. Door RT-PCR werd aangetoond dat ze allen geëxpresseerd worden en dus functionele moleculen voorstellen. Het doel van deze stage is onderzoek te verrichten naar de functie van deze globines.
In een eerste benadering zal de potentiële rol van de globines in het O2 en NO metabolisme onderzocht worden. Hiertoe zal de invloed van verlaagde zuurstofspanning en van NO toediening op het expressieniveau van de globines worden bestudeerd adhv real-time quantitatieve PCR (qPCR). Uit ingevroren wormstalen (behandelde en onbehandelde) zal RNA extractie, DNase behandeling en cDNA synthese worden gedaan. Alvorens de eigenlijke qPCR reacties uit te voeren zullen geschikte referentiegenen voor normalisatie geselecteerd en experimenteel gevalideerd worden.
In een tweede benadering zal weefsel-specifieke expressie van een selectie van de C. elegans globines geëvalueerd worden adhv GFP-reporterconstructen. Deze constructen zullen worden aangemaakt via een fusie-PCR strategie waarbij in een eerste PCR de promotor en het volledige gen wordt geamplificeerd. Het DNA coderend voor GFP wordt in een aparte PCR-reactie geamplificeerd. Het volledige construct wordt dan bekomen door PCR op het mengsel met een gepast primer paar voor het fusieproduct. Dit construct wordt vervolgens via biolistische transformatie in pha-1 mutante wormen geïntroduceerd. pha-1 wormen zijn temperatuur sensitief en 100% lethaal bij 25°C. Co-transformatie van het pha-1 gen genereert het wild-type fenotype en vormt een goed selectie systeem. Aangezien voor elke transformatie grote hoeveelheden wormen nodig zijn, zal een continue cultuur in stand worden gehouden.
Voorstel (2005-2006): Moleculaire karakterisatie van de globine gen familie in de nematode C. elegans
Caenorhabditis elegans is een modelorganisme dat al vele jaren wordt bestudeerd door onderzoekers van verschillende vakgebieden. Deze nematode is in het laboratorium eenvoudig te kweken met een korte generatietijd. De enige vereisten zijn een vochtige atmosfeer, kamertemperatuur en bacteriën als voedsel. De volwassen worm is ongeveer 1 mm lang en er is dus slechts een beperkte ruimte nodig voor de cultuur. C. elegans was het eerste multicellulair organisme waarvan de genomische sequentie (100 Mb met ongeveer 21 000 genen) volledig bepaald werd.
Het belang van C. elegans als modelorganisme in de biomedische sector wordt bepaald door de evolutionaire conservering van de fundamentele mechanismen die een rol spelen bij het functioneren van een multicellulair organisme. Van verschillende humane genen bestaan homologen in deze nematode waarvan de exon-intron structuur eveneens sterk geconserveerd is. Meer dan 50% van alle tot nu toe bekende humane ziektegenen hebben een homoloog in C. elegans, waardoor het als model door de farmaceutische industrie wordt gebruikt voor het screenen naar nieuwe therapeutische targets.
Ons onderzoek focust zich op de moleculaire analyse van globines in C. elegans.
Globines zijn eiwitten die haem binden en die eenzelfde ruimtelijke structuur, de globine-opvouwing, aannemen. Deze wordt gevormd door 6 tot 8 α-helices die gezamenlijk een soort 3-lagige sandwich vormen van 140-160 aminozuren. Globines vertonen een zeer sterke structurele en functionele diversiteit. De mens bezit 4 verschillende types globines: hemo-, myo-, neuro- en cytoglobine. In het genoom van de nematode C. elegans werden maar liefst 35 verschillende sequenties voorspeld met overtuigende globine signatuur en verwantschap met gekende globines. De doelstelling van dit project is de karakterisatie van deze 35 kandidaat globines.
Allereerst willen we de voorspelde sequenties experimenteel verifiëren, aangezien genpredictieprogramma’s ongeveer 20% van de voorspelde genen foutief annoteren door verkeerde keuze van mogelijke splicing sites. Daarom worden alle globine sequenties gevalideerd en waar nodig gecorrigeerd door middel van reverse transcriptase PCR (RT-PCR) en DNA sequentieanalyse.
Weefselspecifieke expressie kan onderzocht worden met behulp van merker genen (vb. GFP, green fluorescent protein) waarbij reporterconstructen worden aangemaakt. GFP is een fluorescent proteine en onmiddellijke observatie van de distributie van dit proteïne in levende wormen is mogelijk doordat de worm transparant is. Via GFP reportergenconstructen zal onderzocht worden waar precies de globines tot expressie komen in de worm.
In laboratoriumomstandigheden bij 20°C neemt een volledige levenscyclus van C. elegans, van eieren tot volwassen dier dat eieren produceert, 3.5 dagen in beslag.
Het laboratorium beschikt over heel wat expertise inzake synchrone cultuur van C. elegans. De levenscyclus van C. elegans bestaat uit 4 larvale stadia, het dauerstadium en het adult stadium. Wij kunnen dus de expressie van al deze globines opvolgen in functie van de levenscyclus door middel van RT-PCR.
De belangrijkste maar experimenteel ook moeilijkst toegankelijke problematiek betreft de vraag naar het functionele aspect: wat doen die 35 kandidaatglobines in vivo? Een voor de hand liggende benadering berust op geninactivatie door RNAi: introductie van dubbelstrengig RNA induceert degradatie van het overeenkomstig mRNA. Een eenvoudige techniek bestaat erin de wormen op te groeien op een getransformeerde E. coli stam (HT115) die het gecloneerd dubbelstrengig RNA aanmaakt.
Voor verdere functionele karakterisatie zal voor alle globine genen onderzocht worden in welke mate vermindering van de zuurstofspanning tot 0%, 7% en 12% invloed heeft op hun expressie niveaus door middel van real-time quantitatieve PCR (QPCR). QPCR is een methode om nauwkeurig nucleinezuren te kwantificeren waarbij in iedere cyclus de amplificatie wordt gevolgd door de toename aan fluorescentie-intensiteit te meten van intercallerende stoffen of sequentiespecifieke probes.
Gebruikte technieken: RNA extractie, cDNA synthese, RT-PCR, gelelektroforese, real-time quantitatieve PCR, sequentie-analyse, RNAi, GFP.
Het C. elegans globine onderwerp is toegankelijk voor meerdere studenten.
Samenvatting eindwerk 2006-2007: Moleculaire karakterisatie van de globine genfamilie in de nematode C. elegans
Als bodembewonend organisme wordt C. elegans regelmatig met hypoxische en anoxische condities geconfronteerd. Door een gepaste respons is C. elegans in staat deze condities te overleven. Er werd altijd aangenomen dat de zuurstofopname van C. elegans afhankelijk was van diffusie, dus was de ontdekking van het globine ZK637.13 een grote verrassing. Ondertussen zijn al 33 potentiële globinegenen geïdentificeerd in dit organisme. Globines worden ook wel respiratoire proteïnen genoemd vanwege het transport en de versnelling van de diffusie van zuurstof naar de mitochondria, die hun belangrijkste en eerst ontdekte functies zijn. Een rol in het stikstofmetabolisme werd slechts recent ontdekt voor deze proteïnen (14).
Door de analyse van de expressiewaarden van de globinegenen onder hypoxische en anoxische condities wordt getracht een bijdrage te leveren in de ontrafeling van de functie van deze globines. Hierbij vertonen zes globines (ZK637.13, F19H6.2, R11H6.3, T19C4.5, R102.9 en F35B12.8) een opregulatie bij hypoxie in vergelijking met normoxie. Hoewel deze resultaten nog bevestigd moeten worden in onafhankelijke experimenten suggereren ze dat deze globines een rol kunnen spelen in het opnemen, transporteren en opslaan van zuurstof en bij de bescherming tegen oxidatieve stress. De overige globines, die geen veranderde expressie vertonen, zouden deel kunnen uitmaken van het stikstofmetabolisme. Bij anoxische condities wordt geen opregulatie waargenomen.
Aan de hand van weefselspecifieke expressieanalyse kunnen de globines gelokaliseerd worden in C. elegans en zo meer vertellen over waar ze hun functie uitoefenen en zo hun functie specificeren. In dit eindwerk worden enkel de voorbereidende stappen van dit proces uitgevoerd en besproken. Deze bestaan uit het aanmaken van het reporterconstruct en bijhorende klonering en de isolatie van het pBX-plasmide.
De Ins/IGF-1 pathway heeft een rechtstreeks verband met de levensduur van C. elegans. Er kan worden aangetoond dat een mutatie in deze pathway de levensduur kan verlengen en zorgen voor een verhoogde stress resistentie en een verhoogde activiteit van superoxide dismutase (SOD) en catalase. C. elegans bevat vijf sod-genen, die coderen voor CuZn-SOD (bevindt zich extracellulair of in het cytosol) en Mn-SOD (bevindt zich in de mitochondria). Deze SOD enzymen bieden een bescherming tegen oxidatieve stress door het verwijderen van reactieve zuurstof- en stikstofverbindingen (ROS en NOS). Na identificatie van stabiele referentiegenen worden met behulp van real-time qPCR de expressiewaarden van de vijf sod-genen in zes verschillende stalen (N2, daf-2, daf-16, daf-2;daf-16, dauerlarve en J3 larvaal stadium) bestudeerd. Hierbij wordt waargenomen dat sod-1 en sod-3 een opregulatie vertonen in de langlevende mutant daf-2 en dus een rol kunnen spelen bij de eliminatie van ROS en NOS en zo zorgen voor een verlengde levensduur. De dauerlarve vertoont een opregulatie van sod-4 en sod-5. Aangezien dit larvale stadium pas tot expressie komt bij ongunstige omstandigheden kan gesteld worden dat deze een beschermende functie hebben. Sod-2 vertoont geen expressieverandering en wordt dus wellicht niet gereguleerd door de Ins/IGF-1 pathway.
|
Tags: biotechnology biology |
Address
|
K.L. Ledeganckstraat 35
9000 Gent
Belgium |
Contacts
|
Traineeship supervisor
David Hoogewijs
09 2645266 David.Hoogewijs@Ugent.be |
|
|