KULAK, Laboratorium voor trombose onderzoek
Contact details
Traineeship proposition
Abstract
Testimony
Admin
Stageonderwerp 2012-2013: In vivo expressie van humane groeifactoren in gehumanizeerde muizen ter optimalisatie van humane T en B cel differentiatie
Deze studie kadert in een onderzoeksproject dat het genereren van humane antistoffen in gehumanizeerde muizen tot doel heeft. Hiervoor worden immuundeficiënte muizen getransfereerd met humane stamcellen, waardoor er een functioneel humaan immuunsysteem zal ontwikkelen. Immunizatie met antigen naar keuze kan dan leiden tot de vorming van specifieke humane antistoffen in deze muizen.
Het humanizeren van NSG muizen leidt tot een hoge graad van humaan/muis chimerisme, maar tot op heden zijn we er nog niet in geslaagd om hoogaffiene specifieke humane immuunresponsen op te wekken. Dit is mogelijks te wijten aan de gebrekkige muis-tot-humane kruisreactiviteit, wat leidt tot slechts partieel functionele humane immuuncellen. Dit willen we omzeilen door in vivo expressie van cruciale humane GF te induceren die momenteel ontbreken in ons model. Voor twee humane GF (CD40L en Blys) hebben we momenteel reeds transiënte in vivo expressie kunnen induceren door (herhaaldelijk) hydrodynamische de expressievectoren te injecteren in de muizen. Dit had een positief effect op de differentiatie en maturatie van B en T cellen. In een volgende fase willen we stabiele in vivo expressie van deze GF bekomen door de respectievelijke genen te gaan cloneren in het Sleeping Beauty transposon systeem. In de stageperiode is het de bedoeling dat de student de expressievector(en) voor stabiele integratie aanmaakt door middel van recombinante DNA technieken en tegelijk de bekomen vectoren in vivo valideert.
Stageonderwerp 2008-2009
De ziekte van von Willebrand (VWD) is één van de meest voorkomende bloedingsziekten bij de mens en wordt veroorzaakt door afwijkingen in von Willebrand factor (VWF), een multimeer plasma-eiwit dat een belangrijke rol vervult in de primaire hemostase. De huidige behandelingen voor deze aandoening zijn gericht op het (slechts) tijdelijk herstellen van de hemostase door het defecte of afwezige VWF te vervangen of aan te vullen. Een aantrekkelijke optie voor de behandeling van VWD is gentherapie, temeer daar, naast het beoogde langdurig effect, de aandoening veroorzaakt wordt door een defect in één enkel gen en het eiwit gesecreteerd wordt in de bloedcirculatie, wat het specifiek richten naar bepaalde organen en weefsels overbodig maakt.
In deze studie worden verschillende strategieën voor gentherapie voor VWD onderzocht: (i) het verder uitbouwen van de reeds ontwikkelde /ex vivo /gentherapie-strategie via lentivirale transductie van endotheliale precursorcellen in diermodellen, (ii) een uitbreiding hiervan naar de /ex vivo /transductie van CD34+ hematopoëtische stamcellen, (iii) het onderzoeken van VWF-expressie door levercellen na hydrodynamische VWF-injectie van muizen en (iv) een rechtstreekse /in vivo /lentivirale virusbehandeling. Voor deze (dier)experimenten beschikken we over een VWF-knockout muizenkolonie. Voor elke gevolgde strategie zal nagegaan worden in welke mate het transgeen geproduceerd VWF kan zorgen voor een verbetering van het bloedingsprobleem bij deze muizen. De experimenten zullen dan ook bestaan uit het analyseren van het geproduceerde VWF, zowel kwantitatief (VWF:Ag ELISA) als kwantitatief (binding van VWF bloedplaatjes (VWF:RCo ELISA), binding van VWF aan collageen (VWF:CBA ELISA), binding van VWF aan de anti-hemofilie factor VIII (FVIII-bindingsELISA), multimeeranalyse. Verdere technieken die ook gebruikt zullen worden zijn immunologische kleuringen en fluorescentiemicroscopie, isolatie en kweek van precursor- en stamcellen, flow-cytometrie, productie van plasmide-DNA en viruspartikels, maar ook dierexperimenten zoals het meten van de bloedingstijd en het uitvoeren van een trombosemodel. Afhankelijk van de fase waarin het onderzoek zich bevindt op het moment van de stage, zal de student deelnemen aan de lopende experimenten.
In deze studie worden verschillende strategieën voor gentherapie voor VWD onderzocht: (i) het verder uitbouwen van de reeds ontwikkelde /ex vivo /gentherapie-strategie via lentivirale transductie van endotheliale precursorcellen in diermodellen, (ii) een uitbreiding hiervan naar de /ex vivo /transductie van CD34+ hematopoëtische stamcellen, (iii) het onderzoeken van VWF-expressie door levercellen na hydrodynamische VWF-injectie van muizen en (iv) een rechtstreekse /in vivo /lentivirale virusbehandeling. Voor deze (dier)experimenten beschikken we over een VWF-knockout muizenkolonie. Voor elke gevolgde strategie zal nagegaan worden in welke mate het transgeen geproduceerd VWF kan zorgen voor een verbetering van het bloedingsprobleem bij deze muizen. De experimenten zullen dan ook bestaan uit het analyseren van het geproduceerde VWF, zowel kwantitatief (VWF:Ag ELISA) als kwantitatief (binding van VWF bloedplaatjes (VWF:RCo ELISA), binding van VWF aan collageen (VWF:CBA ELISA), binding van VWF aan de anti-hemofilie factor VIII (FVIII-bindingsELISA), multimeeranalyse. Verdere technieken die ook gebruikt zullen worden zijn immunologische kleuringen en fluorescentiemicroscopie, isolatie en kweek van precursor- en stamcellen, flow-cytometrie, productie van plasmide-DNA en viruspartikels, maar ook dierexperimenten zoals het meten van de bloedingstijd en het uitvoeren van een trombosemodel. Afhankelijk van de fase waarin het onderzoek zich bevindt op het moment van de stage, zal de student deelnemen aan de lopende experimenten.
Stageonderwerp 2007-2008
Gentherapie voor de ziekte van von Willebrand
De ziekte van von Willebrand (VWD) is één van de meest voorkomende bloedingsziekten bij de mens en wordt veroorzaakt door afwijkingen in von Willebrand factor (VWF), een multimeer plasma-eiwit dat een belangrijke rol vervult in de primaire hemostase. De huidige behandelingen voor deze aandoening zijn gericht op het (slechts) tijdelijk herstellen van de hemostase door het defecte of afwezige VWF te vervangen of aan te vullen. Een aantrekkelijke optie voor de behandeling van VWD is gentherapie, temeer daar, naast het beoogde langdurig effect, de aandoening veroorzaakt wordt door een defect in één enkel gen en het eiwit gesecreteerd wordt in de bloedcirculatie, wat het specifiek richten naar bepaalde organen en weefsels overbodig maakt.
In deze studie worden verschillende strategieën voor gentherapie voor VWD onderzocht: (i) het verder uitbouwen van de reeds ontwikkelde ex vivo gentherapie-strategie via lentivirale transductie van endotheliale precursorcellen in diermodellen, (ii) een uitbreiding hiervan naar de ex vivo transductie van CD34+ hematopoëtische stamcellen, (iii) het onderzoeken van VWF-expressie door levercellen na hydrodynamische VWF-injectie van muizen en (iv) een rechtstreekse in vivo lentivirale virusbehandeling. Voor deze (dier)experimenten beschikken we over een VWF-knockout muizenkolonie. Voor elke gevolgde strategie zal nagegaan worden in welke mate het transgeen geproduceerd VWF kan zorgen voor een verbetering van het bloedingsprobleem bij deze muizen. De experimenten zullen dan ook bestaan uit het analyseren van het geproduceerde VWF, zowel kwantitatief (VWF:Ag ELISA) als kwantitatief (binding van VWF bloedplaatjes (VWF:RCo ELISA), binding van VWF aan collageen (VWF:CBA ELISA), binding van VWF aan de anti-hemofilie factor VIII (FVIII-bindingsELISA), multimeeranalyse. Verdere technieken die ook gebruikt zullen worden zijn immunologische kleuringen en fluorescentiemicroscopie, isolatie en kweek van precursor- en stamcellen, flow-cytometrie, productie van plasmide-DNA en viruspartikels, maar ook dierexperimenten zoals het meten van de bloedingstijd en het uitvoeren van een trombosemodel. Afhankelijk van de fase waarin het onderzoek zich bevindt op het moment van de stage, zal de student deelnemen aan de lopende experimenten.
Stageonderwerp 2006-2007
Optimalizatie panningsprocedure op Monolith kolom
Op de molonith kolom wordt vWF covalent gebonden, vervolgens wordt een faag bibliothheek op de kolom gelopen. Bindende fagen (met affiniteit voor vWF) worden geëlueerd en geinfecteerd in E. coli cellen. Deze cyclus wordt 2-3 herhaald totdat we specifieke fagen bekomen die binden aan vWF.
De faagkolonies worden verder gekarakteriseerd: peptidesequentie, affiniteit voor vWF,…
Monolith affiniteitskolom
Eén of meerdere geselecteerde faagkolonies worden covalent gebonden op de monolith kolom. De opzuivering van vWF uit plasma, bloed wordt geoptimaliseerd. Het bekomen vWF wordt dan vervolgens gekarakteriseerd.
De resterende componenten uit het bloed zoals cellen en andere eiwitten lopen door de kolom. Wat gebeurt er met de rode bloedcellen tijdens de kolompassage? Treedt er al of niet lyse op?
Gebruikte technieken:
- Phage display technology
- chromatografie
- SDS-PAGE en Western Blotting
- ELISA
- Microscopie
Stageonderwerp 2004-2005
- Optimalizatie panningsprocedure op Monolith kolom Op de molonith kolom wordt vWF covalent gebonden, vervolgens wordt een C6 faag bibliothheek op de kolom gelopen. Bindende fagen ( met affiniteit voor vWF) worden geëlueerd en geïnfecteerd in E. coli cellen. Deze cyclus wordt 2-3 herhaald totdat we specifieke fagen bekomen die binden aan vWF. De faagkolonies worden verder gekarakteriseerd : peptidesequentie, affiniteit voor vWF,…
- Monolith affiniteitskolom één of meerdere geselecteerde faagkolonies worden covanlent gebonden op de monolith kolom. De opzuivering van vWF uit plasma, bloed wordt geoptimaliseerd. Het bekomen vWF wordt dan vervolgens gekarakteriseerd.
Download Presentatie (1.32 MB)Abstract Bachelor Project 2019-2020 (ism PharmAbs): Evaluation of antigen-antibody binding using FO-SPR
This project is part of the activities of PharmAbs, the KU Leuven technology platform for development of new antibody-based drugs and diagnostics. The development trajectory of antibodies is an intensive process that requires a considerable amount of resources. Evaluating the biochemical binding properties of antibodies is an essential element in this process. Therefore, an easy-to-use, fast and reliable methodology is indispensable. Moreover, when applied early on in the research phase, this could significantly increase cost-effectiveness of antibody development.
The purpose of this study is to determine if it is possible to evaluate the binding between an antigen and antibody using fiber optic surface plasmon resonance (FO-SPR).
The method used for analyzing the binding between an antigen and antibody is FO-SPR. The FO-SPR device uses an optical dip fiber that functions as a mass sensitive sensor. For this research a fixed setup was used in which the antigen (a biotinylated peptide) is immobilized to the optical fiber surface. After functionalization, the sensor can be used to dip in an antibody containing solution. In this project 3 monoclonal antibody clones were used. The association and dissociation between the antigen and antibody was be measured in real-time. The data acquired by the FO-SPR device were then analyzed through non linear curve fitting to provide information on the binding kinetics (kon, koff and KD). In addition to experiments performed during this project, an additional dataset was used to analyze in parallel.
Multiple association-dissociation sensorgams were recorded for all clones in independent experiments. Non-linear regression allowed determine kinetic binding parameters. Two clones showed nanomolar binding affinities. Of note, substantial spreading in the kinetic parameters was documented between experiments.
This study demonstrates that it is possible to evaluate the binding of an antigen and antibody using FO-SPR. Future work will have to address the observed reproducibility issues. Therefore, another antigen-antibody pair will be used and the kinetic parameters obtained through the FO-SPR system will be need to benchmarked.
Samenvatting eindwerk 1 2011-2012: Introductie van puntmutaties en domeindeleties in het metalloprotease ADAMTS13
Het vasculair systeem is een essentieel onderdeel van elk levend organisme. Beschadigingen en bloedverlies moeten dan ook zo goed en zo snel mogelijk hersteld worden. De Von Willebrand factor is een multimeer glycoproteïne dat nauw betrokken is bij de primaire hemostase. VWF hecht zich aan blootgesteld collageen en vangt circulerende bloedplaatjes om een initiële plaatjesprop te vormen. VWF circuleert onder de vorm van multimeren met een verschillende grootteorde. De grootste, de high en UL VWF multimeren zijn ook de meest hemostatisch actieve vormen. Regulatie van VWF is noodzakelijk om ongewenste propvorming te vermijden. Dit gebeurt door inwerking van het multidomein plasmaproteïne ADAMTS13 op VWF. ADAMTS13 knipt immers VWF in kleinere, minder reactieve multimeren via een complex proces. Een deficiëntie aan ADAMTS13 leidt vaak tot kenmerkende bloedingsziektes. TTP of trombotische trombocytopenische purpura is één van de belangrijkste ADAMTS13 deficiënties. De ziekte wordt gekenmerkt door quasi ondetecteerbare ADAMTS13 levels of door een sterke daling in ADAMTS13 activiteit, veroorzaakt door auto-immuun inhibitorische antilichamen tegen het protease of door een congenitale aandoening die de productie of activiteit van ADAMTS13 verhindert.
De complexe interactie tussen ADAMTS13 en VWF vindt op verschillende locaties in de vasculatuur plaats. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen knipping van VWF in circulatie, ter hoogte van release uit Weibel-Palade lichaampjes en VWF vastgehecht aan vrijgekomen collageen. Gedetailleerde exosites in de N-terminale ADAMTS13 domeinen zijn reeds opgehelderd. Er moet echter nog veel onderzoek gebeuren naar de functie van exosites gelegen op de C-terminale staartdomeinen. Dit zowel met behulp van in vivo als in vitro experimenten. Ook het onderzoek naar TTP is nog volop aan de gang. Screenen van patiënt exon DNA op eventuele mutaties kan een licht werpen op het ontstaan van congenitale TTP.
In deze bachelorproef worden twee mutante vormen van ADAMTS13 onderzocht, het katalytisch inactieve mT2-C2 (geen metalloprotease domein) en de natuurlijk voorkomende mdel(T6-C2) mutant. Dit om in vivo verschillen tussen wild type ADAMTS13 en staartmutanten op te sporen met als doel de functie van exosites ter hoogte van C-terminale staartdomeinen te verklaren. Daarnaast wordt ook “kinetiek” onderzoek uitgevoerd naar de snelheid van ADAMTS13 expressie en de invloed op het knippen van High en UL VWF. Dit door in vivo experimenten (ELISA en multimeeranalyse) met mADAMTS13 WT. TTP patiënt DNA wordt eveneens gescreend op de aanwezigheid van mutaties die een verklaring zouden kunnen vormen voor het ontstaan van TTP.
Het TTP onderzoek bracht naast drie silent mutaties, een nieuwe, nooit eerder beschreven mutatie aan het licht die een mogelijkse verklaring zou kunnen vormen voor de ziekte bij de patiënt. De D187H missense mutatie van het negatief geladen asparaginezuur naar het positief geladen histidine ter hoogte van aminozuur 187, gelegen in het metalloprotease domein van ADAMTS13 heeft waarschijnlijk belangrijke gevolgen. Andere mutaties op dezelfde locatie hebben immers grote invloed op de knipactiviteit van ADAMTS13. De mutatie is met behulp van site-directed mutagenese in plasmide DNA nagebootst en zal in de toekomst getransfecteerd worden in HEK293 cellen en met behulp van in vivo en in vitro experimenten verder onderzocht worden om de invloed van deze mutatie op de ADAMTS13 activiteit en de interactie met VWF aan te tonen.
De in vivo “kinetiek” experimenten met WT ADAMTS13 hebben aan het licht gebracht dat hoewel er na 4u slechts minieme hoeveelheden ADAMTS13 gedetecteerd konden worden, er toch een aanzienlijke daling is in de hoeveelheid High en UL VWF multimeren. Deze daling bereikte echter een plateaufase rond 12u waarbij mogelijks een situatie gecreëerd wordt waar de VWF proteolyse gelimiteerd wordt, zelfs bij blijvend stijgende hoeveelheden van ADAMTS13 expressie.
De klonering met als doel C-terminale staartmutanten te creëren heeft geen grote vooruitgang geboekt. Het protocol is meermaals gewijzigd maar zonder grote veranderingen.Na transformatie in ultracompente E coli cellen zijn er geen kolonies waar te nemen op agarplaten met ampicilline antibioticum. Dit voor zowel mT2-C2 als mdel(T6-C2) mutanten. In de toekomst zal de klonering verder geoptimaliseerd worden.
Samenvatting eindwerk 2 2011-2012: Constructie en in vivo evaluatie van een expressievector voor humaan sCD40L
Volledig humane antilichamen zijn veelbelovende geneesmiddelen voor ziektes zoals kanker en auto-immuunaandoeningen. State of the art technieken om volledig humane antilichamen te verkrijgen zijn faagdisplay en transgene muizen. Een innovatief alternatief voor het maken van volledig humane antilichamen vertrekt vanuit gehumanizeerde muizen. Dit zijn immuundeficiënte muizen die gerepopuleerd worden met humane stamcellen waaruit een humaan immuunsysteem kan ontwikkelen.
In analogie met anderen heeft de onderzoeksgroep van het gastlaboratorium aangetoond dat de humane immuuncellen in gehumanizeerde muizen slechts deels functioneel zijn gezien er tot nu toe enkel antigen specifieke humane antilichaam responsen met lage affiniteit konden opgewekt worden. Eén van de fundamentele problemen van gehumanizeerde muizen is dat de ontwikkeling en functionele rijping van de hematopoëtische stamcellen afgeleide humane immuuncellen onvolledig is. Dit is te wijten aan een gebrekkige kruisreactiviteit op cytokineniveau tussen muis en mens, waardoor de humane cellen beroofd worden van cruciale groeifactoren wat resulteert in gebrekkige humane antistofresponsen.
In dit project zal er tegemoet gekomen worden aan de gebrekkige T helper cel functie in het huidig stamcel gehumanizeerd muismodel. Dit wordt verwezenlijkt door op de CD40-CD40L interactie in te werken. Immers, deze interactie tussen CD40 (op de B cel) en CD40L (op de T helper cel) is cruciaal voor functionele B cel maturatie, wat tot de vorming van antilichamen met een hoge affiniteit voor het doelwit antigen kan leiden. De primaire focus van deze bachelorproef is het ontwikkelen van een expressievector voor soluble humaan CD40L die dan in een later stadium kan gebruikt worden in het gehumanizeerd muismodel.
Het soluble humaan CD40L wordt als eerste gekloneerd in een pSecTag-Igk vector, die over een Igk signaalsequentie en een CMV promotor beschikt. Vertrekkende vanuit dit construct, wordt het soluble humaan CD40L samen met de Igk signaalsequentie, gekloneerd in een vector met leverspecifieke promotor (pBS-HCRHPi vector). Beide constructen werden gecontroleerd via PCR en sequenering en werden vervolgens hydrodynamisch geïnjecteerd in muizen.
Van beide constructen kon na hydrodynamische injectie expressie in het serum gedetecteerd worden waarbij de pBS-HCRHPi-Igk-sCD40L vector een duidelijk langere expressie in tijd vertoont dan de pSecTag-Igk-sCD40L vector.
Finaal werd in deze stageperiode een expressievector aangemaakt voor humaan soluble CD40L die resulteert in serumexpressie van soluble CD40L na hydrodynamische injectie. In een volgende fase van het onderzoek zal het biologisch effect van humaan soluble CD40L expressie in een gehumanizeerd muismodel worden bestudeerd.
Samenvatting eindwerk 2008-2009: Ontwikkeling van lentivirale en transposon-gemedieerde gentherapie voor de ziekte van von Willebrand
Cardiovasculaire aandoeningen zijn in onze Westerse wereld één van de belangrijkste doodsoorzaaken. De ziekte van von Willebrand (VWD) is één van de meest voorkomende bloedingsziekten bij de mens. Deze aandoening is te wijten aan kwantitatief of kwalitatief defect in de von Willebrand factor (VWF), een glycoproteïne die gesynthetiseerd wordt in megakaryocyten en endotheelcellen. VWF heeft twee belangrijke rollen, enerzijds vormt het een brug tussen de bloedplaatjes en de beschadigde bloedvatwand en anderzijds is VWF het dragereiwit van factor VIII. Zoals eerder vermeld wordt VWD veroorzaakt door een defect in VWF. Op basis van deze defecten in VWF wordt VWD onderverdeeld in verschillende types. Aangezien bij type 3 VWD een volledige afwezigheid is van VWF is dit dan ook de meest ernstige vorm van VWD. De huidige behandelingsopties voor VWD patiënten zijn beperkt en gericht op het tijdelijk herstellen van het deficiënte VWF. Door de kortdurende werking is herhaaldelijke toediening vereist, wat meestal resulteert in een verlaagde respons.
In dit onderzoek wordt gezocht naar een alternatieve en betere behandeling voor de VWD. Aangezien de aandoening veroorzaakt wordt door slechts één gen, is het aantrekkelijk om dit gen te vervangen en zo te zorgen voor een permanente correctie. Op deze manier zou het mogelijk zijn om de VWF deficiëntie levenslang te herstellen. Er zijn in dit eindwerk twee soorten gentransfer strategieën die later eventueel kunnen zorgen voor de levenslange herstelling in het VWF gen, namelijk de lentivirale vectoren en het Sleeping Beauty transposon systeem.
Het eerste deel van het project omvat de studie van lentivirale vectoren en plasmiden. Hierbij zijn drie verschillende trajecten lopende, enerzijds worden eukaryote cellen getransduceerd met een reeds aanwezig lentivirale vector. Deze resultaten tonen aan dat de lentivirale vector mVWF tot expressie brengen. Het bereiden van een vectorpreparaat met hogere titer zal toelaten om in vivo studies uit te voeren. Anderzijds wordt de in vivo en in vitro expressie van het lenti-CMV-mVWF-WPRE plasmide bepaald. Ook dit plasmide brengt mVWF efficiënt tot expressie. Dit plasmide zal nu gebruikt worden voor de productie van lentivirale vectoren. De aanwezigheid van het WPRE element zou aanleiding moeten geven tot een hogere expressie van mVWF. Tenslotte worden de CMV-pcDNA-muVWF-rD4-EGFP en CMV-pcDNA-mVWF-rD4-mCherry constructen, die fluorescent gemerkt mVWF tot expressie brengen, gecontroleerd. Alhoewel deze constructen mVWF tot expressie brengen, wordt het eiwit niet gesecreteerd in het medium. Een nieuw construct , naar analogie met hVWF, zal geconstrueerd worden dat het fluorescente label C-terminaal van het mVWF-cDNA draagt.
Het tweede deel van het project omvat de studie van niet-virale gentransfer voor VWD door gebruik te maken van het Sleeping Beauty transposon systeem. Het Sleeping Beauty transposon systeem bestaat uit een transposon dat het mVWF-cDNA bevat en een transposase dat zorgt voor de stabiele integratie van het transposon in het genoom van de cellen. Zowel in vivo als in vivo kon aangetoond worden dat het mVWF-cDNA stabiel geïntegreerd werd in het genoom van CHOK1 cellen en lever cellen respectievelijk daar langdurige expressie van mVWF waargenomen werd. In vivo werden bovendien mVWF expressielevels van 1 % waargenomen tot 28 dagen na injectie. Dankzij het aantonen van gentransfer van het mVWF-cDNA via het Sleeping Beauty transposon systeem in de VWF -/- muis is een eerste belangrijke stap gezet in het ontwikkelen van niet-virale gentherapie voor VWD.
Samenvatting eindwerk 2007-2008: Gentherapie voor de ziekte van von Willebrand: haalbaarheidsstudie van verschillende strategieën
De ziekte van von Willebrand is één van de meest voorkomende erfelijke bloedingsziekten bij de mens en wordt veroorzaakt door een kwalitatief (type 2) of kwantitatief (type 1 of 3) tekort aan von Willebrand factor (VWF). VWF is een glycoproteïne dat een belangrijke rol speelt in de primaire hemostase. In de eerste plaats vormt het een brug tussen de sub-endotheliale structuren in een beschadigd bloedvat en de bloedplaatjes en in de tweede plaats heeft het een belangrijke rol als dragereiwit voor factor acht (FVIII). Tekort aan FVIII leidt tot hemofilie.
Tijdens dit onderzoek wordt gezocht naar de mogelijkheden om de ziekte van von Willebrand te behandelen via gentherapie. Verschillende strategiëen worden hierbij onderzocht.
Een eerste strategie om VWF-deficiëntie te corrigeren, is gebaseerd op het implanteren van Blood outgrowth endothelial cells (BOEC’s). Deze cellen zijn in staat om VWF te produceren en worden in een gelachtige matrix subcutaan geïnjecteerd in VWF -/- muizen. Na implantatie wordt het plasma van deze muizen op regelmatige tijdstippen gecontroleerd op de aanwezigheid van VWF. In het afgenomen plasma wordt echter geen VWF teruggevonden. Als controle wordt in een aantal VWF -/- muizen opgezuiverd VWF subcutaan geïnjecteerd. Ook hier vindt men geen VWF terug in het plasma. VWF is dus niet in staat om het plasma te bereiken. De reden hiervoor is waarschijnlijk de extreme grootte van het eiwit.
In een tweede strategie is het de bedoeling gebruik te maken van het Sleeping Beauty transposon om via een niet-virale methode het correcte gen voor VWF in te bouwen in het genoom van het proefdier. In deze studie is het dan ook de bedoeling om het plasmide te construeren dat nodig is om deze proeven uit te voeren. Hiervoor moet het gen voor muis-VWF uit de pcDNA6.1-muVWF vector geïsoleerd worden om vervolgens ingebouwd te worden in het transposonplasmide pT2-HB-CAG-AMAXA-GFP. Na de succesvolle klonering wordt als extra controle de sequentie van het plasmide bepaald. Door de sterke secundaire structuren van het transposonplasmide verloopt de sequentiebepaling erg moeilijk. Er is dus een verdere optimalisatie nodig zodat kan gecontroleerd worden of de klonering geslaagd is. Na correcte klonering kan dit plasmide gebruikt worden in verdere studies met VWF -/- muizen.
Een derde methode is gebaseerd op in vivo administratie van lentivirale vectoren die coderen voor murine VWF in VWF -/- muizen. Deze virale vectoren zijn immers in staat om het gen te integreren in het genoom van zijn gastheer. In het eerste deel van deze studie gebeurt de karakterisering van deze vector in vitro. Na deze karakterisering wordt de vector neonaal geïnjecteerd in VWF -/- muizen en wordt de expressie van VWF gecontroleerd in het plasma. Vier weken na de injectie wordt er geen VWF teruggevonden in het plasma via ELISA. In de toekomst zullen meer gevoeligere detectiemethodes geprobeerd worden om de expressie van het transgeen VWF na te gaan. Daarna zal via PCR ook de genintegratie gecontroleerd worden. Bovendien bevat het plasma ook geen antilichamen gericht tegen VWF. Dit wijst erop dat VWF niet door een immuunrespons verwijderd is.
Samenvatting eindwerk 2006-2007: Structurele integriteit van von Willebrand factor na monolith affiniteitschromatografie
Von Willebrand factor is een complex multimeer glycoproteïne dat een belangrijke rol speelt in het proces van de hemostase. Het is hoofdzakelijk terug te vinden in het plasma. De grootte van dit multimeer wordt gecontroleerd door het zink-metalloprotease ADAMTS13. Deze gaat namelijk VWF knippen ter hoogte van het A2 domein nadat VWF zich volledig heeft ontrold onder invloed van mechanische krachten.
Aan de hand van een aantal experimenten tracht men in vitro dit fenomeen na te bootsen zoals het in het menselijk lichaam zou plaatsvinden. Tot nu toe is men erin geslaagd onder niet fysiologische omstandigheden VWF bloot te stellen aan denaturerende omstandigheden waardoor ADAMTS13 zijn functie kan beoefenen en VWF gaat knippen ter hoogte van het A2 domein. Hierna kunnen de proteolytische fragmenten van 140 en 176 kDa gescheiden en gedetecteerd worden via Western blot. Deze methode is de ureumtest volgens Furlan.
Het doel van dit werk is duidelijkheid te scheppen over een mogelijks nieuwe methode waarmee men de structurele veranderingen, nodig om ADAMTS13 te laten inwerken op VWF, kan bestuderen. Hierbij maakt men gebruik van een monolith affiniteitskolom waaraan een specifiek polyklonaal antilichaam (RàHuVWF) wordt gekoppeld. Door het polyklonaal karakter van het gekoppelde antilichaam kan er binding optreden met verschillende epitopen op VWF. De kans is ook reëel dat VWF, op meerdere antilichaammoleculen bindt met als gevolg dat er een “ontrollen” van VWF optreedt zodat ADAMTS13 kan knippen.
Bij het gebruik van plasma VWF en opgezuiverd VWF werden de proteolytische fragmenten niet gedetecteerd waardoor er geen evidentie kon gegeven worden dat ADAMTS13 heeft ingewerkt. Uiteraard was er dan ook geen inhiberende werking van het antilichaam 3H9 waar te nemen.
Wel werd er preliminair, een positief resultaat bekomen bij het onderzoek met recombinant VWF waar er zeker in de toekomst verder onderzoek moet worden gedaan. Dit is noodzakelijk omdat aan de hand van deze resultaten het vermoeden bestaat dat er eventueel een beschermende factor voor ADAMTS13 tegen de inhiberende inwerking, in het plasma aanwezig is of dat er eventueel een hogere concentratie aan 3H9 vereist is om de inhiberende werking op ADAMTS13 op te wekken.
Samenvatting eindwerk 2004-2005
Dit werk is een aanzet om von Willebrand factor (vWF) via affiniteitschromatografie op te zuiveren uit plasma. Als chromatografische matrix wordt gebruik gemaakt van een monolith kolom. Monolith kolommen, waartoe de gebruikte cryogels behoren, zijn relatief nieuwe chromatografische matrices. Ze bestaan namelijk uit één stuk en bezitten poriën van 5 – 100 µm diameter. Aan een dergelijke matrix kunnen liganden gekoppeld worden. In dit geval fungeren filamenteuze fagen als ligand. Deze fagen exprimeren peptides aan hun oppervlak die een affiniteit voor vWF bezitten. Na het vinden van een geschikt elutiesolvent kan gestart worden met de eigenlijke chromato-grafie. Wanneer plasma over de kolom gestuurd wordt zullen de fagen specifiek vWF capte-ren. Dit eiwit kan vervolgens met een geschikt solvent geëlueerd worden. Op die manier kan vWF in één stap opgezuiverd worden uit plasma. Via ‘trial’ en ‘error’ is geprobeerd om het systeem op punt te stellen. Verdere optimalisatie is echter gewenst en er dienen nog verschillende experimenten te gebeuren.
Address
|
Etienne Sabbelaan 53
8500 Kortrijk
056/246019 Belgium |
Contacts
|
Traineeship supervisor
Prof. Karen Vanhoorelbeke
056/246019 karen.vanhoorelbeke@kuleuven-kortrijk.be |
|
Traineeship supervisor
Prof. Hans Deckmyn
056/246422 hans.deckmyn@kuleuven-kortrijk.be |
|
Traineeship supervisor
Wim Maes
|
|
Traineeship supervisor
Patricia de Vos
|
|
Traineeship supervisor
Elien De Cock
|